一种改良性能的纤维素内切酶Cel7B突变体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是修饰的7家族糖苷水解酶，具体的来说是一种在高温下有改良性 能的纤维素内切酶Cel7B突变体。
【背景技术】
[0002] 纤维素是地球上非常重要的可再生资源，由纤维素降解产生的糖可以用来发酵生 成生物能源，化学品，及其他高附加值的产品。但是由于纤维素结构的复杂性，导致其高效 水解糖化非常有挑战性。纤维素酶是一系列能够水解纤维素 β_1，4糖苷键的酶总称，包 括纤维素外切酶，纤维素内切酶和β_葡糖苷酶。其中外切酶从纤维素链的端点剪切糖苷 键并释放主要产物纤维二糖，内切酶从纤维素表面随机剪切以产生新的纤维素链末端，而 β-葡糖苷酶则主要把纤维二糖转化成葡萄糖。
[0003] 丝状真菌里氏木霉能够分泌出大量的纤维素酶（>50g/L)，已经被成功应用于工业 化生产。其分泌的纤维素酶主要包括：外切酶Cel7A(占总酶量50% )，Cel6A(20% )，；内 切酶 Cel7B(15% )，Cel5A(10% )，Cell2A(l% )，Cel45A(〈l% );葡糖苷酶，葡聚糖单氧化 酶Ce161A(〈l%)等。除了在生物能源转化过程中的潜在应用，纤维素酶在动物饲料加工、 纺织品洗涤、纸浆加工等方面等发挥重要作用。
[0004] 动物饲料中的抗营养因子如木质纤维素阻碍了动物对饲料的有效消化。而纤维素 酶的使用尤其是高温纤维素酶的使用破坏木质纤维素的结构，从而促进动物对饲料中营养 的吸收。另外纤维素酶把纤维素转化成糖，为动物提供新的营养物质。
[0005] 纤维素酶还可以用来处理纺织品，如织物软化、棉布抛光、牛仔布的整染、以及纺 织品的洗涤等。例如纤维素酶可以加到洗涤剂中来去除含有污渍或者泥土的纤维素。通常 洗涤剂中还包括其它酶组分如淀粉酶和脂肪酶等。
[0006] 纤维素酶还可以用于纸浆加工，如纸浆漂白、脱墨、纤维改性等以减轻传统的酸碱 处理造成的废水污染。纤维素酶通过与纤维素作用辅助氧气或者超氧化物对纸浆进行漂白 以消除污染物氯对环境的危害。通常纤维素酶会与木聚糖酶组合实现助漂的功能。
[0007] 纤维素的高温酶解有很多的优势，例如高温下体系粘度的降低允许更多的投料 量，高温降低微生物污染的风险，与高温预处理更加的协调，以及更快的水解速度。但 是来源于里氏木霉的纤维素酶在高温下的活性和稳定性都不好（Takashima, Iikura et al. 1998, Lantz, Goedegebuur et al. 2010)。而来源于细菌的高温纤维素酶的表达量通常 则非常底，经济性较差。所以提高里氏木霉纤维素酶的稳定性是非常有必要的。
[0008] 7家族糖苷水解酶占里氏木霉纤维素酶的比例大于65%，对于其稳定性的提高有 重要应用价值。国际专利W02012/036810A2对里氏木霉内切酶Cel7B的热稳定性进行突变 体改造，该改造基于B-因子方法（Reetz, D Carballeira et al. 2006)，即在柔性区域选择 突变位点，然后对这些位点进行突变筛选。发现如下一个或者多个突变体有更好的稳定性 或者活性：G230K, G230A, G230E, G230Q, G230R, D113L, D113S, D115T, D115G。与野生酶相比 3突变体G230A-D113S-D115T提高了 T5Q4°C，并在60°C下对微晶纤维素 Avicel活性提高了 2· 5 倍。
[0009] 蛋白质稳定性的提高可以通过定向进化或理性设计来完成。理性设计通常采 用的方法包括：提高蛋白质的核心堆积（Dahiyat and Mayo 1997),去除埋藏的极性基 团（Blaber,Lindstrom et al. 1993, Hendsch, Jonsson et al. 1996)，改变表面带电基团 分布（Makhatadze，Loladze et al. 2003, Gribenko, Patel et al. 2009, Schweiker and Makhatadze 2009)，引入二硫键（Robinson and Sauer 2000)等。每一种方法都有成功的例 子。但由于稳定蛋白质折叠构象的相互作用非常复杂，通过理性设计提高蛋白质热稳定性 仍然是一个非常有挑战性的科学问题。而新方法的引入将为解决这一问题提供新的契机。 [0010] 分子动力学模拟计算都表明在蛋白质解折叠过程中，有一些区域会先发生结构变 化，这些区域被称为"热点"(Meharenna and Poulos 2010, Wang and Duan 2011)，而削弱热 点区域的相互作用则显著降低蛋白的热稳定性（Meharenna and Poulos 2010)。模拟计算 发现同源的嗜热蛋白和嗜温蛋白在高温下热点区域体现出较大差异（Merkley, Parson et al. 2010)。核磁共振实验方法也被用来研究热点（Ding, Louis et al. 2004)。但是目前尚 未有关于通过对热点区域理性设计提高蛋白质稳定性的报道。
[0011] 蛋白质的热稳定性对于其在生物技术领域的应用是很重要的。例如在工业酶中， 好的热稳定性意味着更久的存活时间和升高的反应温度。而在蛋白质药物中，好的热稳定 性则保证了更加持久的存活时间和药效。
【发明内容】
[0012] 本发明目的在于提供一种在高温下有改良性能的纤维素内切酶Cel7B突变体。
[0013] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0014] 一种改良性能的纤维素内切酶Cel7B突变体，7家族糖苷水解纤维素内切酶Cel7B 含至少一个或多个氨基酸位点突变。
[0015] 所述7家族糖苷水解纤维素内切酶Cel7B突变体来源于里氏木霉或其它真菌体 系。
[0016] 所述突变体与SEQ ID N0:1的氨基酸比对，其突变位点位于G4C、T15C、F71C、E73C、 G81C、S87C、V105C、G155C、N160C、G169C、N182C、G183C、S213C、A296C、Y326C、G343C、S168T、 N92Y、N323D中的一个或者几个氨基酸位点。
[0017] 所述突变体与SEQ ID NO: 1的氨基酸比对，其突变位点位为G4C-F71C、G4C-E73C、 N160C-G183C、S213C-A296C、Y326C-G343C、G81C-V105C、G155C-N182C、T15C-S87C 或 G155C-G169C的氨基酸位点。
[0018] 所述突变体与SEQ ID NO: 1的氨基酸比对，其突变位点位为G4C-F71C/ N160C-G183C、 G4C-F71C/G155C-N182C G155C-N182C/N160C-G183C、 G4C-F71C/ N160C-G183C/G155C-N182C、G4C-F71C/N160C-G183C/S168T 或 G4C-F71C/N160C-G183C/ S168T/N92Y/N323D的氨基酸位点。
[0019] 一种良性能的纤维素内切酶Cel7B突变体的应用，所述突变体可作为催化剂用于 催化反应。
[0020] 所述突变体可作为高温催化用于高温催化反应。