一种多角体蛋白包裹型植酸酶的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种多角体蛋白包裹型植酸酶。具体地讲，本发明 涉及共表达植酸酶基因及多角体蛋白基因的重组多角体杆状病毒的构建及多角体包裹型 植酸酶。
【背景技术】
[0002] 植酸酶是一种能将饲料中植酸磷水解成无机磷和肌醇的新型单胃动物饲料添加 剂，主要应用于猪、鸡、鸭等单胃动物和水产养殖类动物，应用范围广、需求量大。它可使植 物性饲料中磷的利用率提高60%，粪便中磷排泄量减少40%，同时还可降低植酸的抗营养 作用。因此在饲料中添加植酸酶对提高畜禽业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要 意义。它在欧洲使用较为广泛，但在我国到目前为止，植酸酶并没有在饲料中得到广泛的推 广应用，主要原因在于：1、植酸酶在天然材料中的含量太低，难以大量生产，生产成本昂贵； 2、植酸酶的抗逆性，尤其是热稳定性不能完全满足饲料及饲料加工的要求。
[0003] 昆虫病毒多角体（POlyhedra)是指昆虫病毒在感染宿主细胞后产生的多面体粒 子，其主要用来包裹病毒粒子。它的功能是保护包裹的病毒颗粒免受不良环境的破坏，比 如：高温、干燥、辐射等，以及它对各种蛋白分解酶也有抗性，并且在酸性条件下极其稳定， 而在碱性环境下易溶解并释放出病毒粒子。如：Ijiri等人将蛋白激酶C(protein kinase C)包裹进入了质型多角体中，并发现包裹型的蛋白激酶C相对于没有经过包裹的蛋白有更 强生物学活性和持续的药物缓释效果；被多角体包裹的表皮生长因子（epidermal growth factor)不仅药效延长了，而且其能抵抗高强度的射线破坏；曹翠平等人利用多角体包埋 外源蛋白时发现，经过包埋的EGFP蛋白（绿色荧光蛋白）放置2个月后仍能检测到绿色荧 光，而干燥处理30min后同样能检测到蛋白活性。这些研宄表明多角体是耐酸、抗辐射、抗 干燥并具有包裹异源活性蛋白特性的优良载体。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种多角体蛋白包裹型植酸酶，经多角体包裹后的植酸酶具 有耐酸、抗高温、高效、持续、缓释等特点。具体是包括利用杆状病毒表达系统，同时将质型 多角体蛋白基因和植酸酶基因分别构建到PFastBacTMDual载体的PH与PlO启动子下，并 在植酸酶基因前引入SP引导基因，构建含有植酸酶基因及多角体基因的重组杆状病毒；通 过该重组杆状病毒感染昆虫细胞（如Sf9或Sf21)，可以在细胞内产生大量被多角体包裹 的植酸酶的颗粒；通过分离、提取纯化感染了重组杆状病毒的细胞获得大量的多角体颗粒； 对纯化到的多角体颗粒进行植酸酶活性分析，验证多角体包裹型植酸酶具有耐酸、抗高温、 高效、持续、缓释等特性。
[0005] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种多角体蛋白包裹型植酸酶，由植 酸酶aPPA分子和包裹层组成，所述包裹层为昆虫质型多角体蛋白，所述植酸酶aPPA分子以 固态分子的形式被包裹于所述昆虫质型多角体蛋白内；所述多角体蛋白包裹型植酸酶的颗 粒大小为0. 1?1 μπι，植酸酶蛋白浓度占比为10%?70%。
[0006] 优选地，所述多角体蛋白包裹型植酸酶是通过如下方法制成，具体步骤如下：
[0007] Α、利用病毒基因组所展现的密码子偏倚性，选取植酸酶的密码子，合成植酸酶 aPPA基因，所述植酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示；
[0008] B、将步骤A的所述植酸酶aPPA基因构建到pFastBacTMDual载体的plO启动子下， 并在所述植酸酶aPPA基因前引入SP引导基因，构建含有植酸酶aPPA基因及多角体基因的 重组杆状病毒载体，所述SP引导基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，所述多角体基因 的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示；
[0009] C、将步骤B中的所述重组杆状病毒载体与杆状病毒骨架重组，获得重组杆状病 毒；
[0010] D、用步骤C中的所述重组杆状病毒感染昆虫细胞，分离纯化多角体颗粒，即得到 多角体蛋白包裹型植酸酶。
[0011] 优选地，步骤D中所述昆虫细胞为Sf9昆虫细胞或Sf 21昆虫细胞。
[0012] 优选地，所述多角体蛋白包裹型植酸酶中植酸酶蛋白浓度占比为45 %?55 %。
[0013] 与现有技术相比，本发明的优点如下，通过构建含有含编码植酸酶的嵌合基因重 组多角体杆状病毒载体，并将含编码植酸酶的基因插入到病毒骨架载体中，获得能表达多 角体包裹型植酸酶的重组多角体杆状病毒BmBacmicL与其他方式表达的植酸酶作为饲料添 加剂种种不足（如酶活低、稳定性差、易失活等）相比，由重组多角体杆状病毒BmBacmid表 达产生的多角体蛋白包裹型植酸酶具有耐酸、抗高温、持久缓释等效果。
【附图说明】
[0014] 图1是Bacmid-polyhedrin-aPPA病毒感染的细胞内多角体的产生情况（X20倍 数下显微镜拍照）；
[0015] 图2是Bacmid-polyhedrin-EGFP-aPPA病毒感染的细胞内多角体的产生情况 (X20倍数下显微镜拍照）；
[0016] 图3是未经病毒感染的正常细胞内多角体的产生情况（X20倍数下显微镜拍 照）；
[0017] 图4是Bacmid-polyhedrin-EGFP-aPPA病毒感染的细胞分离获得的多角体在可见 光下情况（X20倍数下显微镜拍照）；
[0018] 图5是Bacmid-polyhedrin-EGFP-aPPA病毒感染的细胞分离获得的多角体在荧光 下情况（X20倍数下显微镜拍照）；
[0019] 图6是Bacmid-polyhedrin-aPPA病毒感染的细胞分离获得的多角体在可见光下 情况（X20倍数下显微镜拍照）；
[0020] 图7是植酸酶在昆虫表达系统中的SDS-PAGE分析图（1、重组杆状病毒 Bacmid-polyhedrin感染细胞后分离的多角体；2、重组杆状病毒Bacmid-polyhedrin-aPPA 感染细胞后分离的多角体；3、重组杆状病毒Bacmid-polyhedrin-EGFP-aPPA感染细胞后分 离的多角体）；
[0021] 图8是多角体蛋白包裹型植酸酶appA及植酸酶（EKEAR)的热稳定性对比图；
[0022] 图9是多角体蛋白包裹型植酸酶appA及植酸酶（EKEAR)的pH耐受性曲线对比 图；
[0023] 图10是胃蛋白酶对多角体蛋白包裹型植酸酶appA及植酸酶（EKEAR)活性的影响 对比图；
[0024] 图11是胰蛋白酶对多角体蛋白包裹型植酸酶appA及植酸酶（EKEAR)活性的影响 对比图。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合具体实施例对本发明一种多角体蛋白包裹型植酸酶作进一步的详细说 明。
[0026] 一种多角体蛋白包裹型植酸酶，由植酸酶aPPA分子和包裹层组成，所述包裹层为 昆虫质型多角体蛋白，所述植酸酶aPPA分子以固态分子的形式被包裹于所述昆虫质型多 角体蛋白内；所述多角体蛋白包裹型植酸酶的颗粒大小为〇. 1?I ym，植酸酶蛋白浓度占 比为10%?70%。
[0027] 所述多角体蛋白包裹型植酸酶是通过如下方法制成，具体步骤如下：
[0028] Α、构建合成的aPPA基因
[0029] 利用病毒基因组所展现的密码子偏倚性，优选的密码子的确定可通过详尽地调 查可得到的病毒或昆虫基因的序列而定，如调查多角体蛋白的20种氨基酸及终止信号的 编码密码子后，优选密码子很容易地被找出，甘氨酸，GGC(60% );天冬氨酸，GAC(74% ) 对 GAT(26% );精氨酸，GGC(37% )或 CGT(33% )对 CCG(1% )或 CGA(1% );天冬酰胺， AAC (86% )对 AAT (14 % );异亮氨酸，ATC (69% )对 ATA (6% );苏氨酸，ACC (53% )对 ACA(4% )或ACC(13% );半脱氨酸，TGC(73% )对TGT(27% );酪氨酸，TAC(81% )对 TAT(19% );苯丙氨酸，TTC(65% )对 TTT(35% );谷氨酰胺，CAA(94% )对 CAG出％ );组 氨酸，CAC(83% )对CAT(17% )和脯氨酸，CCC(58% )对CCA(10% )。基于密码子运用中 的优势及明显的差异，我们设计并合成了 aPPA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示；
[0030] B、含植酸酶aPPA与多角体蛋白共表达载体pPH-aPPA构建
[0031] 由上海生物工程公司人工合成多角体基因 polyhedrin构建到pUC57载体上，并在 上下游引BamHI和NotI位点，多角体基因 polyhedrin的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示； 将多角体基因 polyhedrin用BamHI/Notl从pUC57载体上切下来，经过胶回收纯化，构建到 pFastBacDual载体polyhedrin启动子下游相应的位点，连接产物转化大肠杆菌ToplO,挑 取阳性克隆测序验证，获得多角体表达载体PPH ;
[0032] 由上海生物工程公司人工合成SP引导基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示； 嵌合基因由SP引导基因和植酸酶aPPA基因构成，并在两端分别引入XhoI和KpnI位点，将 合成的全长片段SP-aPPA构建到pUC57载体；
[0033] 将SP-aPPA片段用Xhol/Kpnl从pUC57上酶切下来，经过胶回收纯化，构建到pPH 载体PlO启动子下游相应的位点，连接产物转化大肠杆菌ToplO，挑取阳性克隆测序验证， 获得多角体与aPPA共表达载体pPH-aPPA ;
[0034] C、含有aPPA基因的重组杆状病毒BcNPV的构建
[0035] 取共表达载体pPH-aPPA IOOng加入100 μ 1大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，热 击转化，涂布在含50 μ g/ml卡那霉素、10 μ g/ml四环素、7 μ g/ml庆大霉素、100 μ g/ml Blu〇-gal，40 μ g/ml IPTG 的 LB 固体培养基上，37°C培养 48h ;
[0036] 挑取白色克隆进行PCR鉴定与提取质粒送上海生工测序鉴定，将阳性克