一种提高白桦抗逆性的基因及其编码的蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提高白桦抗性的基因及其编码的蛋白。
【背景技术】
[0002] 白桦（Betula platyphylla Suk.)为桦木科桦属植物，为落叶乔木，生长速度快、 是东北地区次生林的先锋树种，耐寒能力强，喜酸性土壤，在胶合板、单板的家具制造以及 纸浆材等方面有广泛的应用。由于其重要的生态、观赏和实用经济价值，历来被列为国家科 技计划研宄的重要树种之一。对白桦品种改良的范围也在不断扩大，其主要目标是培育速 生、优质和高抗的林木新白桦品种。但是传统的品种改良手段存在效果不明显，周期长，成 功率低的问题。利用基因工程技术进行遗传改良可以解决上述问题，但首先需要找到在白 桦中能够提升白桦性能的基因。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种提高白桦抗逆性的基因及其编码的蛋白，为之后培育高 抗逆性白桦品种奠定物质基础。
[0004] 本发明提尚白枠抗逆性的基因的核昔酸序列如SEQ ID NO :1所不。
[0005] 本发明提高白桦抗逆性的基因所编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0006] 本发明提高白桦抗逆性的基因全长为915bp，编码的蛋白分子由304个氨基酸组 成（SEQ ID NO :2)，分子量为34. 4kDa，理论等电点为5. 95。
[0007] 本发明提高白桦抗逆性的基因被命名为BplMYB46基因，实验表明本发明提高白 桦抗逆性的基因 BplMYB46基因导入白桦后受干旱和盐胁迫而明显诱导表达，证明本发明 Bp 1MYB46基因参与白桦的抗旱耐盐胁迫应答反应。
[0008] 用本发明BP1MYB46基因构建植物过表达载体，然后通过农杆菌介导法转入野生 型白桦中，发现过表达BplMYB46的转基因白桦受NaCl、ABA和Mannitol胁迫后白桦的长 势优于对照组野生型白桦，平均鲜重是野生型白桦的1. 5倍，平均根长是野生型白桦的2. 5 倍。受NaCl、ABA和Mannitol胁迫后过表达BplMYB46的转基因白桦中超氧化物歧化酶 (SOD)活性和过氧化物酶（POD)含量明显增加，使过氧化氢含量、活性氧含量和细胞的受损 伤程度降低，表明BplMYB46基因具有明显的抗逆能力。
【附图说明】
[0009] 图1是【具体实施方式】二中在非胁迫条件（control)下和在NaCl、ABA、Mannitol 的胁迫条件下阳性转基因白桦株系植株（0E9和0E10)与野生型白桦植株（WT)的生长状况 图。
[0010] 图2是【具体实施方式】二中在非胁迫条件（control)下阳性转基因白桦株系植株 (0E9和0E10)与野生型白桦植株（WT)的相对鲜重对比图。
[0011] 图3是【具体实施方式】二中受NaCl胁迫条件下阳性转基因白桦株系植株（0E9和 OElO)与野生型白桦植株（WT)的相对鲜重对比图。
[0012] 图4是【具体实施方式】二中受ABA胁迫条件下阳性转基因白桦株系植株（0E9和 0E10)与野生型白桦植株（WT)的相对鲜重对比图。
[0013] 图5是【具体实施方式】二中受Mannitol胁迫条件下阳性转基因白桦株系植株（0E9 和0E10)与野生型白桦植株（WT)的相对鲜重对比图。
[0014] 图6是【具体实施方式】二中在非胁迫条件（control)下阳性转基因白桦株系植株 (0E9和0E10)与野生型白桦植株（WT)的相对根长度对比图。
[0015] 图7是【具体实施方式】二中受NaCl胁迫条件下阳性转基因白桦株系植株（0E9和 0E10)与野生型白桦植株（WT)的相对根长度对比图。
[0016] 图8是【具体实施方式】二中受ABA胁迫条件下阳性转基因白桦株系植株（0E9和 0E10)与野生型白桦植株（WT)的相对根长度对比图。
[0017] 图9是【具体实施方式】二中受Mannitol胁迫条件下阳性转基因白桦株系植株（0E9 和0E10)与野生型白桦植株（WT)的相对根长度对比图。
[0018] 图10是【具体实施方式】二中DAB染色试验的染色结果图。
[0019] 图11是【具体实施方式】二中DCFH-DA染色试验的染色结果图。
[0020] 图12是【具体实施方式】二中PI染色试验的染色结果图。
[0021] 图13是【具体实施方式】二中SOD活性测定试验的活性检测结果图。
[0022] 图14是【具体实施方式】二中POD活性测定试验的活性检测结果图。
【具体实施方式】
[0023] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0024] 一：本实施方式提高白桦抗逆性的基因 BplMYB46基因的核苷酸序 列如SEQ ID NO :1所示。
[0025] 本实施方式提高白桦抗逆性的基因 BplMYB46基因所编码蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO : 2 所示。
[0026] 本实施方式BplMYB46基因全长为915bp，编码的蛋白分子由304个氨基酸组成，如 SEQ ID NO :2所示，分子量为34. 4kDa，理论等电点为5. 95。
【具体实施方式】 [0027] 二：本实施方式对提高白桦抗逆性的基因 Bp 1MYB46基因进行试验：
[0028] 一、在BplMYB46基因上、下游分别引入Sma I酶切位点，设计合成带有Sma I酶切 位点的BplMYB46基因序列及引物；
[0029] 二、进行 PCR 扩增；PCR 反应为 94 °C 预变性 5min，94 °C 变性 30 s、58 °C 退火 30 s、72 °C 延伸lmin，循环30次，最后在72°C保温5min ;
[0030] 三、收集到的DNA片段纯化后与经Sma I酶切的ProKII载体连接，再转化大肠杆 菌ToplO菌株；
[0031] 四、PCR验证和测序鉴定正确的重组质粒（ProkII-BplMYB46)用电导法转入根癌 农杆菌EHA105菌株中，得到阳性重组菌；
[0032] 五、步骤四获得的阳性重组菌采用根癌农杆菌介导法转化野生型白桦，并在含有 卡那霉素40mg/L、头孢霉素600mg/L的WPM培养基上进行筛选，壮苗后取2?3片叶子提取 白桦DNA进行PCR检测，含有Bp 1MYB46基因的为阳性转基因白桦株系；
[0033] 六、将步骤五获得的阳性转基因白桦株系和野生型白桦的组培苗转移到土中，在 人工气候室中培养；
[0034] 七、以两个月的土培苗为材料，分别用水、浓度为200mmol/L的NaCl溶液、 100 μ mol/L的脱落酸（ABA)溶液和浓度为300mmol/L的甘露醇（Mannitol)溶液处理阳性 转基因白桦株系植株和野生型白桦植株，在人工气候室中培养7?10天，观察和测量胁迫 与非胁迫条件下白桦植株的鲜重和根长，并进行3次生物学重复。
[0035] 本实施方式步骤四中正确的重组质粒ProkII-Bp 1MYB46经PCR扩增可得到与 BplMYB46基因大小一致的条带（基因片段），再经过测序，该片段与BplMYB46基因的核苷 酸序列相同。
[0036] 本实施方式步骤五中壮苗后在苗高3?4cm时取2?3片叶子提取白桦DNA。
[0037] 本实施方式步骤五获得16个阳性转基因白桦株系，本实施方式步骤六选用其中 的两个阳性转基因白桦株系0E9和OElO的组培苗转移到土继续培养。
[0038] 在非胁迫条件（control)下阳性转基因白桦株系植株（0E9和0E10)的生长状况 与野生型白桦植株（WT)基本保持一致；而在NaCl、ABA以及Mannitol的非生物胁迫条件下 阳性转基因白桦株系植株（0E9和0E10)的白桦长势优于野生型白桦植株（WT)。实验结果 如图1所示，实验表明BplMYB46基因在白桦中可成功表达，并使阳性转基因白桦的抗逆性 大幅提升。
[0039] 以野生型白桦植株的根长和鲜重为对照（设置值为1)，进行相对计算，结果如图 2?9所示，从图中可以看到在非胁迫条件下（Control)，阳性转基因白桦株系植株（0E9和 0E10)和野生型白桦植株（WT)的相对鲜重和根长度没有明显的差别；而在NaCl、ABA以及 Mannitol的非生物胁迫条件下阳性转基因白桦株系植株（0E9和0E10)的相对鲜重和根长 度大约分别是野生型白桦植株（WT) 1. 5倍和1. 5倍。实验进一步说明BplMYB46基因在白 桦具有抗旱、耐盐能力。
[0040] 将阳性转基因白桦株系植株（0E9和0E10)和野生型白桦植株（WT)的两个月组培 苗取出，放入分别浓度为150mmol/L的NaCl溶液、50 μ mol/L的脱落酸（ABA)溶液和浓度为 200mmol/L的甘露醇（Mannitol)溶液中进行浸泡处理，取植株叶片用于DAB染色、DCFH-DA 染色和PI染色。
[0041] I) DAB 染色：