一种重组甲酸脱氢酶及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种重组甲酸脱氢酶及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 氧化还原酶在六大类酶中占30%?35%，其在催化制备手性醇、羟基酸、氨基酸 等方面具有重要的应用价值。在氧化还原酶所催化的反应中，随反应的进行会消耗一定量 的辅酶，其中约80%的反应以尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，NADH)作辅酶。由于辅酶NADH 价格昂贵，为控制生产成本，在将氧化还原酶应用于药物及其中间体的生产时，必须提供高 效、低成本的辅酶再生系统：即把辅酶从氧化态再生为还原态，或从还原态再生为氧化态， 以使辅酶的含量保持在一定的水平，保证酶催化反应的顺利进行。
[0003] 辅酶的循环是氧化还原酶工业化大规模生产的瓶颈因素，甲酸脱氢酶（Formate Dehydrogenase，FDH，EC 1. 2. 1. 2)是辅酶NAD+和NADH再生循环体系中的关键酶，它可以将 甲酸氧化为CO2，同时将NAD +还原为NADH。甲酸脱氢酶催化的反应不可逆且反应彻底，反应 中涉及的甲酸价格低廉且很多酶对其有很高的耐受性。此反应唯一的副产物即CO 2，而CO2 对反应体系中任何酶的活性均无影响，且易于从反应体系中逃逸，不影响产物的分离纯化。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的之一在于提供一种甲酸脱氢酶基因突变体及其编码的重组甲酸脱 氢酶，含有该基因的重组表达载体、基因工程菌及其制备方法，以及该重组甲酸脱氢酶在辅 酶NAD +和NADH再生循环体系中的应用，并将其用于相关原料药及医药中间体的生产。
[0005] -种甲酸脱氢酶基因突变体，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0006] -种重组甲酸脱氢酶，选自（1)由SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列组成的蛋白质；或 是（2)由SEQ ID NO. 2中所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸 且具有甲酸脱氢酶活性的由（1)衍生的蛋白质。
[0007] -种含有所述的甲酸脱氢酶基因突变体的重组载体。其可通过本领域常规方法将 本发明的重组甲酸脱氢酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述的载体可为 本领域常规的各种载体，优选pETDuet-Ι。
[0008] 一种生产所述的重组甲酸脱氢酶的基因工程菌，所述基因工程菌中包含所述的甲 酸脱氢酶基因突变体。
[0009] 所述基因工程菌的宿主细胞优选大肠埃希氏菌（Escherichia coli)BL21(DE3); 进一步优选将本发明所述的含甲酸脱氢酶基因突变体的重组载体转染大肠埃希氏菌 (Escherichia coli)BL21(DE3)所得；最优选保藏号为 CCTCC NO :M 2014304,保藏日为 2014年6月30日，保藏机构为中国典型培养物保藏中心的基因工程菌E. Coli BL21(DE3) FDH 1109〇
[0010] 一种所述的重组甲酸脱氢酶的制备方法，包括如下步骤：培养本发明所述的基因 工程菌，获得重组表达的重组甲酸脱氢酶。
[0011] 所述的制备方法，优选在一定生产罐发酵条件下，进行工业化制备所述重组甲酸 脱氢酶的步骤；其中所述生产罐发酵条件优选：DO 30%以上，空气流量I: I. 5vvm。
[0012] 本发明所述的重组甲酸脱氢酶在辅酶NAD+和NADH再生循环体系中的应用。
[0013] 本发明所述的重组甲酸脱氢酶在生产2-[3-(E)-[3-[2_(7-氯-2-喹啉基）乙烯 基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯中的应用。
[0014] 有益效果：
[0015] 本申请开发了一个具有较好催化活性的重组甲酸脱氢酶，用于辅酶NAD+和NADH 再生循环体系，它可以将NAD+还原为NADH，以使反应体系的辅酶含量保持在一定的水平，从 而保证氧化还原酶所催化反应的顺利进行。
[0016] 本发明所涉及的酶具有优良的催化活力，其所催化的反应简单温和，无废物排放， 反应转化率高，具有较好的应用前景。
【附图说明】
[0017] 图1在由重组酮还原酶催化制备2-[3-(E)-[3-[2_(7-氯-2-喹啉基）乙烯基] 苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯的反应中，重组甲酸脱氢酶参与了辅酶NADH的再生。
[0018] 图2甲酸/FDH辅酶再生系统
[0019] 生物材料保藏信息
[0020] 本发明提供的工程菌属于大肠埃希氏菌（Escherichia coli)，分类命名为大肠杆 菌 BL21(DE3)FDH1109,拉丁文名 Escherichia coli BL21(DE3)FDH 1109,已于 2014 年 6 月 30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO : M2014304。
【具体实施方式】
[0021] 根据本发明一个实施例的重组甲酸脱氢酶基因，其来源博伊丁假丝酵母Candida boidinii (Genbank:DQ458777)。根据易错PCR和定点突变方法对其进行突变，从而获得该 重组氨基转移酶突变体目的基因，其基因序列为SEQ ID NO. 1。
[0022] 根据本发明一个实施例的重组甲酸脱氢酶突变体的蛋白序列为SEQ ID NO. 2。
[0023] 根据本发明一个实施例的重组载体，包括本发明实施例的重组甲酸脱氢酶突变体 基因，载体为PETDuet-I，采用乳糖启动子，诱导剂为IPTG。
[0024] 根据本发明一个实施例的生产甲酸脱氢酶突变体的基因工程菌具有包括甲酸脱 氢酶多肽基因突变体的重组载体。
[0025] 具体地，本发明的基因工程菌为保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)的保藏 编号为CCTCC NO :M 2014304的基因工程菌。
[0026] 实施例1基因工程菌的建立
[0027] 通过NCBI查阅甲酸脱氢酶基因（Genbank: DQ458777)，人工合成甲酸脱氢酶基因 片段，以该基因片段为模版，通过PCR扩增扩展该片段（片段两侧加 BamH I和EcoR I内切 酶片段）其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。并利用BamH I和EcoR I内切酶位点将基因 插入pETDuet-Ι质粒中，将连接后的载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中建立甲酸脱氢酶基因 工程菌。其中PCR扩增甲酸脱氢酶基因的引物为：正向引物TATGGTGCTGGTAAACACGC (SEQ ID NO. 4)，反向引物 CTTTGGTAACGTATTCACCG (SEQ ID NO. 5)。
[0028] 实施例2甲酸脱氢酶突变体基因的获得
[0029] 本研宄利用易错PCR和定点突变的方法，对甲酸脱氢酶进行了蛋白质工程改造。 易错PCR是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓 度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，来改变扩增 过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随 机突变体。
[0030] 本研宄采用较低的Taq聚合酶在特定措施下很容易向扩增产物中掺入随机突变 的原理，同时利用Mn 2+替代天然辅助因子Mg 2+增加易错概率。
[0031] 50 μ 1易错PCR反应体系为：10X扩增缓冲液5 μ 1，4种dNTP混合物（2. 5mmol/ L)各 4μ1，正、反向引物各 40pmol，模板DNA 0.5yg，Taq DNA 聚合酶 0.4yL(5U/yL)， Mn2+O. 5 μ L(10 mmol/L)，加双蒸水至50 μ 1。其中扩增甲酸脱氢酶突变体基因为：正向引物 TATGGTGCTGGTAAACACGC(SEQ ID NO. 4)，反向引物 CTTTGGTAACGTATTCACCG (SEQ ID NO. 5)。
[0032] 易错？0?反应条件为：94°0预变性61^11，94°0变性3〇8,54°0变性3〇8,72°0变性 120s，进行30个循环；于72°C下继续延伸10min，冷却至4°C。
[0033] 实验流程
[0034] 按照实施例1的方法PCR扩增甲酸脱氢酶基因并利用BamH I和EcoR I内切酶位 点将基因插入至pETDuet-Ι质粒中，作为基因突变模板；
[0035] 按照上述方法，易错PCR扩增甲酸脱氢酶的基因，扩增后基因片段链接至 pETDuet-Ι载体，将连接后的载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中建立甲酸脱氢酶基因突变文 库；利用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，pETDuet-Ι质粒为载体，表达扩展甲酸脱氢酶，高通量 筛选高活性突变株；突变后对高活性甲酸脱氢酶基因进行鉴定。筛选出的高活性甲酸脱氢 酶突变体基因的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0036] 按实施例1所述方法构建表达该甲酸脱氢酶多肽突变体的基因工程菌，并将其命 名为 E.Coli BL21(DE3)ST