MicroRNA221-3p在制备表皮细胞中的方法及应用
MicroRNA 221-3p在制备表皮细胞中的方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种MicroRNA221-3p在促表皮细胞增殖中 的新用途，也即一种促进表皮细胞增殖的方法，及其将该方法应用于制备皮肤移植物。
【背景技术】
[0002] 皮肤有重要的保障作用，因其位于体表，所以，经常发生皮肤的各种创伤。皮肤 创面修复是烧创伤治疗的重要组成部分，继各种皮瓣和微粒皮用于移植手术后，近年来 又兴起了表皮细胞培养和体外构建皮肤组织的组织工程技术，并已成为医学生物工程领 域的研宄热点（Rhett JM, Ghatnekar GS, Palatinus JA, 0' Quinn M, Yost MJ, Gourdie RG. Novel therapies for scar reduction and regenerative healing of skin wounds. TrendsBiotechnol. 2008Apr ;26(4) :173-80)表皮细胞分离和培养技术可为大面积深度烧 伤创面的治疗提供充足的皮肤组织细胞。
[0003] 但是，表皮细胞体外培养条件苛刻，增殖缓慢，限制了其在临床治疗中的应用。体 外培养表皮细胞以游离方式或组织工程皮肤的方式应用于皮肤创面，是以表皮细胞修复皮 肤创面的一种新方法。
[0004] MicroRNA(miRNA)是由21-25个核苷酸构成的分子，MicroRNA通过抑制其靶分 子mRNA的翻译或者促进其降解而起到负性基因表达调控作用，随着近年研宄的不断深 入，人们发现微小RNA分子在细胞功能及器官发育中有着广泛的作用，如MicroRNA参与 了胚胎的早期发育过程。在皮肤的发育过程中，有报道称miR-205可调控皮肤干细胞增 殖（Wang D, Zhang Z, 0'Loughlin E, Wang L, Fan X，Lai EC, Yi R. MicroRNA-205 controls neonatal expansion of skin stem cells by modulating the PI(3)K pathway. Nat Cell Biol. 2013 Oct ;15(10) :1153-63), miR-21 是一种可调控表皮细胞中 BMP 的功能 (Ahmed MI, Mardaryev AN, Lewis CJ, Sharov AA, Botchkareva NV. MicroRNA-21 is an important downstream component of BMP signalling in epidermal keratinocytes. J Cell Sci. 2011 Oct 15 ;124(Pt 20) :3399-404.),进而调控表皮细胞的生长和增殖， MicroRNA-221可抵消或抑制细胞周期抑制剂p27的作用，从而促进肥大细胞增殖（Mayoral RJ，Pipkin ME，Pachkov M，van Nimwegen E，Rao A，Monticelli S.MicroRNA-221-222 regulate the cell cycle in mast cells. J Tmmunol. 2009 Jan I ; 182 (I):433-45)〇 另 有研宄发现Micr〇RNA-221-3p和肝细胞的增殖密切相关（Yuan Q，Loya K，Rani B，M6bus S,Balakrishnan A, Lamle J, Cathomen T,Vogel A, Manns MP, Ott M, Cantz T,SharmaAD. MicroRNA-221 overexpression accelerates hepatocyte proliferation during liver regeneration. Hepatology. 2013 Jan ；57 (I):299-310)〇
[0005] MicroRNA与细胞功能的研宄越来越多，但目前尚无 MicroRNA-221-3p过表达可促 进表皮细胞增殖的研宄及应用的文献报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供Micr〇RNA221-3p的新用途，本发明的另一目的在于提供 一种促进表皮细胞增殖的方法，本发明的第三目的在于提供Micr 〇RNA221-3p或者利用 Micr〇RNA221-3p促进表皮细胞增殖的方法在制备组织工程皮肤和皮肤移植物中的应用。
[0007] 本发明为了克服表皮细胞体外培养（制备）中增殖缓慢的缺陷，提高表皮细胞在 创面修复中的临床应用效果，提供了借助MicroRNA-具体为Micr 〇RNA221-3p来实现表皮 细胞快速增殖的新方法。
[0008] 本发明所述的 MicroRNA221_3p，Accession number :MIMAT0000278,具体序列如 下：
[0009] agcuacauugucugcuggguuuc(SEQ ID NO:1)〇
[0010] 本发明的第一方面，提供了 MicroRNA221-3p的新用途，即MicroRNA221-3p在制备 促进表皮细胞增殖的试剂中的应用。
[0011] 所述的试剂，为提高MicroRNA221-3p表达量的试剂，包括但不限于以下任一：
[0012] A)MicroRNA221-3p ；
[0013] B)含有MicroRNA 221-3p编码基因的重组载体；
[0014] C)含有MicroRNA 221-3p编码基因的重组病毒；
[0015] D)含有MicroRNA 221-3p编码基因的重组病毒载体。
[0016] 所述的MicroRNA221-3p，经查找人类基因组数据库，由位于X染色体的基因簇编 码，其基因序列定位于Xpll. 3。其序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0017] 所述的 MicroRNA 221-3p 前体（MI0000298)，其序列如下：
[0018] UGAACAUCCAG⑶CUGGGGCAUGAACCUGGCAUACAAUGUAGAUUUCUGUGUUCGUUAGGCAACAGCUA CAUUGUCUGCUGGGUUUCAGGCUACCUGGAAACAUGUUCUC(SEQ ID N0:2)。
[0019] 所述的促进表皮细胞增殖，是指体外培养的条件下，通过质粒转染或慢病毒感染 的方式上调表皮细胞中的MicroRNA 221-3P，和阴性对照相比，MicroRNA221-3p高表达的 表皮细胞增殖速度加快。
[0020] 本发明的第二方面，提供一种促进表皮细胞增殖的方法，该方法包括：构建一种 MicroRNA 221-3p高表达的表皮细胞。
[0021] 较佳地，该方法包括I )和III )、或者II )和III):
[0022] I )人工合成MicroRNA221-3p的成熟体，经脂质体转染，获得MicroRNA 221-3py 高表达的的表皮细胞；
[0023] II )构建含有MicroRNA221-3p的编码基因的重组载体、构建含有MicroRNA221-3p 的编码基因的重组病毒，或构建含有MicroRNA221-3p的编码基因的重组病毒载体（简称为 GFP-MIR-221-3p);
[0024] 将获得的重组载体、重组病毒，或重组病毒载体转染表皮细胞，获得 MicroRNA221-3p高表达的表皮细胞；
[0025] III)步骤I )或II )得到的MicroRNA221-3p高表达的表皮细胞，放入37°C 5% 二氧化碳培养箱静置培养，所用培养基同未做处理的表皮细胞，均为20%胎牛血清，高糖 DMEM0
[0026] 本发明在表皮细胞培养时，采用绘制生长曲线法测量表皮细胞的增殖速度，发现 Micr〇RNA221-3p高表达的表皮细胞，比转染阴性对照的表皮细胞，增殖速度显著加快。
[0027] 本发明的第三方面，提供了 Micr〇RNA221-3p在制备组织工程皮肤和皮肤移植物 中的应用，以及或者一种促进表皮细胞增殖的方法在制备组织工程皮肤和皮肤移植物中的 应用。
[0028] 本发明获得了一种MicroRNA 221-3p高表达的表皮细胞（也称为重组表皮细胞）， 所述的重组表皮细胞进一步应用于制备组织工程皮肤和皮肤创面修复材料。
[0029] 本发明提供了一种具有促进表皮细胞增殖的产品（试剂），所述的活性成分为以 下任一：
[0030] A)MicroRNA221-3p ；
[0031] B)含有MicroRNA 221-3p编码基因的重组载体；
[0032] C)含有MicroRNA 221-3p编码基因的重组病毒；
[0033] D)含有MicroRNA 221-3p编码基因的重组病毒载体。
[0034] 本发明经实验证明，MicroRNA221-3p过表达后，可抑制PTEN的表达。PTEN， Phosphatase and tensinhomology，是与细胞骨架蛋白同源的第10号染色体缺失的磷酸酶 基因，PTEN可抑制表皮细胞的增殖。本发明的MicroRNA221-3p过表达后，通过抑制PTEN 的表达，可显著促进表皮细胞的增殖。因此说明，Micr〇RNA221-3p与表皮细胞增殖有关， Micr〇RNA221-3p可用于制备表皮细胞、促进表皮细胞增殖。本发明克服表皮细胞体外培养 中增殖缓慢的缺陷，使表皮细胞可以大量地、低成本地在创面修复、皮肤移植中得到广泛的 临床。
【附图说明】
[0035] 图1为荧光显微镜观察慢病毒载体介导GFP-MIR-221-3p在表皮细胞中的表达情 况；其中A为GFP-MIR-221-3p转染的表皮细胞（简称为EC high)的明视野，清晰可见表皮细 胞的形态；B图为A图中EChigh细胞的暗视野，可见荧光；C为慢病毒空载体转染的表皮细胞 (简称为EC m)的明视野；D为图为C图中ECm的暗视野，可见荧光。
[0036] 图2为计数法绘制GFP-MIR-221-3p感染后表皮细胞的生长曲线，测定其增殖能 力。可见EC high增殖速度加快。
[0037] 图3为免疫组化鉴定GFP-MIR-221-3p慢病毒感染后EC中特异性抗原的表达；其 中A为EC high中广谱角蛋白的检测；B为EChigh中角蛋白14的检测；C为ECne中广谱角蛋白 的检测；D为EC ne中角蛋白14的检测。
[0038] 图 4 为 western-blot 和 RT-PCR 检测 MicroRNA221-3p 高表达后 PTEN 的表达，其 中A为western-blot的观察结果，B图显示MicroRNA221_3p表达增加，C图显示PTEN表达 降低。
[0039] 图5为GFP-MIR-221-3p感染后表皮细胞的安全性鉴定。图中箭头表示为细胞移 植部位，大体观察从左向右依次是A !EChigh移植组，B :EC "移植组，C : EC移植组，D :PBS移 植组。苏木精-伊红（HE)染色观察结果从左向右依次是E !EChigh移植组，F ^(:^移植组， G :EC移植组，H :PBS移植组。结果显示各组致瘤实验均为阴性；，大体观察未见异常；HE染 色结果，也未见畸胎瘤形成。
【具体实施方式】
[0040] 现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0041] 本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或 按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0042] 实施例1 :稳定高表达Micr〇RNA221-3p的表皮细胞的获得
[0043] -、表皮细胞获得
[0044] 成人体皮来自长海医院整形外科。原代培养得到表皮细胞。
[0045] 取包皮后将其装在含有无菌PBS或者DMEM培养基的无菌离心管内，尽快操作。在 无菌培养皿内以适量75%乙醇酒精棉球反复擦拭包皮1分钟左右。将包皮换到另一个无菌 培养皿中，用含双抗磷酸盐缓冲液Phosphate Buffered Saline(PBS)液（青、链霉素浓度 均为lOOIU/ml)彻底清洗，尽量剪去皮下组织，PBS液洗两遍。将皮片剪切成l-2mm宽的条 状，浸泡于约5倍于组织的0. 25% Dispase酶液中，4°C消化16-18小时。从取出皮片上轻 轻撕离表皮，双抗PBS洗两遍。加入适量预热至37°C的胰酶消化液（
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种MicroRNA221-3p在促表皮细胞增殖中 的新用途，也即一种促进表皮细胞增殖的方法，及其将该方法应用于制备皮肤移植物。
【背景技术】
[0002] 皮肤有重要的保障作用，因其位于体表，所以，经常发生皮肤的各种创伤。皮肤 创面修复是烧创伤治疗的重要组成部分，继各种皮瓣和微粒皮用于移植手术后，近年来 又兴起了表皮细胞培养和体外构建皮肤组织的组织工程技术，并已成为医学生物工程领 域的研宄热点（Rhett JM, Ghatnekar GS, Palatinus JA, 0' Quinn M, Yost MJ, Gourdie RG. Novel therapies for scar reduction and regenerative healing of skin wounds. TrendsBiotechnol. 2008Apr ;26(4) :173-80)表皮细胞分离和培养技术可为大面积深度烧 伤创面的治疗提供充足的皮肤组织细胞。
[0003] 但是，表皮细胞体外培养条件苛刻，增殖缓慢，限制了其在临床治疗中的应用。体 外培养表皮细胞以游离方式或组织工程皮肤的方式应用于皮肤创面，是以表皮细胞修复皮 肤创面的一种新方法。
[0004] MicroRNA(miRNA)是由21-25个核苷酸构成的分子，MicroRNA通过抑制其靶分 子mRNA的翻译或者促进其降解而起到负性基因表达调控作用，随着近年研宄的不断深 入，人们发现微小RNA分子在细胞功能及器官发育中有着广泛的作用，如MicroRNA参与 了胚胎的早期发育过程。在皮肤的发育过程中，有报道称miR-205可调控皮肤干细胞增 殖（Wang D, Zhang Z, 0'Loughlin E, Wang L, Fan X，Lai EC, Yi R. MicroRNA-205 controls neonatal expansion of skin stem cells by modulating the PI(3)K pathway. Nat Cell Biol. 2013 Oct ;15(10) :1153-63), miR-21 是一种可调控表皮细胞中 BMP 的功能 (Ahmed MI, Mardaryev AN, Lewis CJ, Sharov AA, Botchkareva NV. MicroRNA-21 is an important downstream component of BMP signalling in epidermal keratinocytes. J Cell Sci. 2011 Oct 15 ;124(Pt 20) :3399-404.),进而调控表皮细胞的生长和增殖， MicroRNA-221可抵消或抑制细胞周期抑制剂p27的作用，从而促进肥大细胞增殖（Mayoral RJ，Pipkin ME，Pachkov M，van Nimwegen E，Rao A，Monticelli S.MicroRNA-221-222 regulate the cell cycle in mast cells. J Tmmunol. 2009 Jan I ; 182 (I):433-45)〇 另 有研宄发现Micr〇RNA-221-3p和肝细胞的增殖密切相关（Yuan Q，Loya K，Rani B，M6bus S,Balakrishnan A, Lamle J, Cathomen T,Vogel A, Manns MP, Ott M, Cantz T,SharmaAD. MicroRNA-221 overexpression accelerates hepatocyte proliferation during liver regeneration. Hepatology. 2013 Jan ；57 (I):299-310)〇
[0005] MicroRNA与细胞功能的研宄越来越多，但目前尚无 MicroRNA-221-3p过表达可促 进表皮细胞增殖的研宄及应用的文献报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供Micr〇RNA221-3p的新用途，本发明的另一目的在于提供 一种促进表皮细胞增殖的方法，本发明的第三目的在于提供Micr 〇RNA221-3p或者利用 Micr〇RNA221-3p促进表皮细胞增殖的方法在制备组织工程皮肤和皮肤移植物中的应用。
[0007] 本发明为了克服表皮细胞体外培养（制备）中增殖缓慢的缺陷，提高表皮细胞在 创面修复中的临床应用效果，提供了借助MicroRNA-具体为Micr 〇RNA221-3p来实现表皮 细胞快速增殖的新方法。
[0008] 本发明所述的 MicroRNA221_3p，Accession number :MIMAT0000278,具体序列如 下：
[0009] agcuacauugucugcuggguuuc(SEQ ID NO:1)〇
[0010] 本发明的第一方面，提供了 MicroRNA221-3p的新用途，即MicroRNA221-3p在制备 促进表皮细胞增殖的试剂中的应用。
[0011] 所述的试剂，为提高MicroRNA221-3p表达量的试剂，包括但不限于以下任一：
[0012] A)MicroRNA221-3p ；
[0013] B)含有MicroRNA 221-3p编码基因的重组载体；
[0014] C)含有MicroRNA 221-3p编码基因的重组病毒；
[0015] D)含有MicroRNA 221-3p编码基因的重组病毒载体。
[0016] 所述的MicroRNA221-3p，经查找人类基因组数据库，由位于X染色体的基因簇编 码，其基因序列定位于Xpll. 3。其序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0017] 所述的 MicroRNA 221-3p 前体（MI0000298)，其序列如下：
[0018] UGAACAUCCAG⑶CUGGGGCAUGAACCUGGCAUACAAUGUAGAUUUCUGUGUUCGUUAGGCAACAGCUA CAUUGUCUGCUGGGUUUCAGGCUACCUGGAAACAUGUUCUC(SEQ ID N0:2)。
[0019] 所述的促进表皮细胞增殖，是指体外培养的条件下，通过质粒转染或慢病毒感染 的方式上调表皮细胞中的MicroRNA 221-3P，和阴性对照相比，MicroRNA221-3p高表达的 表皮细胞增殖速度加快。
[0020] 本发明的第二方面，提供一种促进表皮细胞增殖的方法，该方法包括：构建一种 MicroRNA 221-3p高表达的表皮细胞。
[0021] 较佳地，该方法包括I )和III )、或者II )和III):
[0022] I )人工合成MicroRNA221-3p的成熟体，经脂质体转染，获得MicroRNA 221-3py 高表达的的表皮细胞；
[0023] II )构建含有MicroRNA221-3p的编码基因的重组载体、构建含有MicroRNA221-3p 的编码基因的重组病毒，或构建含有MicroRNA221-3p的编码基因的重组病毒载体（简称为 GFP-MIR-221-3p);
[0024] 将获得的重组载体、重组病毒，或重组病毒载体转染表皮细胞，获得 MicroRNA221-3p高表达的表皮细胞；
[0025] III)步骤I )或II )得到的MicroRNA221-3p高表达的表皮细胞，放入37°C 5% 二氧化碳培养箱静置培养，所用培养基同未做处理的表皮细胞，均为20%胎牛血清，高糖 DMEM0
[0026] 本发明在表皮细胞培养时，采用绘制生长曲线法测量表皮细胞的增殖速度，发现 Micr〇RNA221-3p高表达的表皮细胞，比转染阴性对照的表皮细胞，增殖速度显著加快。
[0027] 本发明的第三方面，提供了 Micr〇RNA221-3p在制备组织工程皮肤和皮肤移植物 中的应用，以及或者一种促进表皮细胞增殖的方法在制备组织工程皮肤和皮肤移植物中的 应用。
[0028] 本发明获得了一种MicroRNA 221-3p高表达的表皮细胞（也称为重组表皮细胞）， 所述的重组表皮细胞进一步应用于制备组织工程皮肤和皮肤创面修复材料。
[0029] 本发明提供了一种具有促进表皮细胞增殖的产品（试剂），所述的活性成分为以 下任一：
[0030] A)MicroRNA221-3p ；
[0031] B)含有MicroRNA 221-3p编码基因的重组载体；
[0032] C)含有MicroRNA 221-3p编码基因的重组病毒；
[0033] D)含有MicroRNA 221-3p编码基因的重组病毒载体。
[0034] 本发明经实验证明，MicroRNA221-3p过表达后，可抑制PTEN的表达。PTEN， Phosphatase and tensinhomology，是与细胞骨架蛋白同源的第10号染色体缺失的磷酸酶 基因，PTEN可抑制表皮细胞的增殖。本发明的MicroRNA221-3p过表达后，通过抑制PTEN 的表达，可显著促进表皮细胞的增殖。因此说明，Micr〇RNA221-3p与表皮细胞增殖有关， Micr〇RNA221-3p可用于制备表皮细胞、促进表皮细胞增殖。本发明克服表皮细胞体外培养 中增殖缓慢的缺陷，使表皮细胞可以大量地、低成本地在创面修复、皮肤移植中得到广泛的 临床。
【附图说明】
[0035] 图1为荧光显微镜观察慢病毒载体介导GFP-MIR-221-3p在表皮细胞中的表达情 况；其中A为GFP-MIR-221-3p转染的表皮细胞（简称为EC high)的明视野，清晰可见表皮细 胞的形态；B图为A图中EChigh细胞的暗视野，可见荧光；C为慢病毒空载体转染的表皮细胞 (简称为EC m)的明视野；D为图为C图中ECm的暗视野，可见荧光。
[0036] 图2为计数法绘制GFP-MIR-221-3p感染后表皮细胞的生长曲线，测定其增殖能 力。可见EC high增殖速度加快。
[0037] 图3为免疫组化鉴定GFP-MIR-221-3p慢病毒感染后EC中特异性抗原的表达；其 中A为EC high中广谱角蛋白的检测；B为EChigh中角蛋白14的检测；C为ECne中广谱角蛋白 的检测；D为EC ne中角蛋白14的检测。
[0038] 图 4 为 western-blot 和 RT-PCR 检测 MicroRNA221-3p 高表达后 PTEN 的表达，其 中A为western-blot的观察结果，B图显示MicroRNA221_3p表达增加，C图显示PTEN表达 降低。
[0039] 图5为GFP-MIR-221-3p感染后表皮细胞的安全性鉴定。图中箭头表示为细胞移 植部位，大体观察从左向右依次是A !EChigh移植组，B :EC "移植组，C : EC移植组，D :PBS移 植组。苏木精-伊红（HE)染色观察结果从左向右依次是E !EChigh移植组，F ^(:^移植组， G :EC移植组，H :PBS移植组。结果显示各组致瘤实验均为阴性；，大体观察未见异常；HE染 色结果，也未见畸胎瘤形成。
【具体实施方式】
[0040] 现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0041] 本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或 按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0042] 实施例1 :稳定高表达Micr〇RNA221-3p的表皮细胞的获得
[0043] -、表皮细胞获得
[0044] 成人体皮来自长海医院整形外科。原代培养得到表皮细胞。
[0045] 取包皮后将其装在含有无菌PBS或者DMEM培养基的无菌离心管内，尽快操作。在 无菌培养皿内以适量75%乙醇酒精棉球反复擦拭包皮1分钟左右。将包皮换到另一个无菌 培养皿中，用含双抗磷酸盐缓冲液Phosphate Buffered Saline(PBS)液（青、链霉素浓度 均为lOOIU/ml)彻底清洗，尽量剪去皮下组织，PBS液洗两遍。将皮片剪切成l-2mm宽的条 状，浸泡于约5倍于组织的0. 25% Dispase酶液中，4°C消化16-18小时。从取出皮片上轻 轻撕离表皮，双抗PBS洗两遍。加入适量预热至37°C的胰酶消化液（
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0访客 来自[中国] 2021年05月29日 23:37请告知那里有 -
0访客 来自[中国] 2021年05月29日 23:37Micro RNA221治疗肝功能衰竭什么公\产品
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