一种尿苷二磷酸葡萄糖的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于化学及生物工程领域；更具体地，本发明涉及一种尿苷二磷酸葡萄糖 (UDPG)的制备方法。
【背景技术】
[0002] 糖核苷酸在功能性寡糖合成，蛋白质、抗生素、黄酮类化合物、青蒿素等结构修饰 方面起到了很好的作用。
[0003] 尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG)是研究最早的糖核苷酸，其可以作为其他种类糖核苷 酸合成前体，比如可在UDPG-4'-差向异构酶作用下生成UDP-Gal，在UDPG脱氢酶作用下 生成UDP-GlcA等等；黄酮类化合物的修饰主要是以UDPG为底物，在糖基转移酶作用下进行 的，比如木犀草素、槲皮素、柚皮素、儿茶素等[中国天然药物，2010,8 (5)，389-400]。
[0004] UDPG 的合成主要是化学合成[Adv. Carbohydr. Chem. Biochem.，28307 (1973)、 J. Org. Chem.，57146 (1992)]、发酵法、酶法转化[J. Org. Chem.，55,1834 (1990)、特表平 7-500248]。化学合成需要对糖基上活性基团进行保护和去保护，催化剂昂贵，反应条件苛 亥IJ，有机溶剂用量大，环境污染严重，反应周期长，得率低。发酵法也存在着产率低的缺点。 由于酶对底物具有较强的立体选择性和专一性使酶法合成UDPG成为一种简便易行的方 式。而且，近年基因重组技术的快速发展，能够以较低的成本大规模生产各种酶，使酶合成 法的优势更为显著。
[0005] 酶法合成糖核苷酸主要是以NTP、葡萄糖-1-磷酸为底物，在相应的焦磷酸化酶 作用下生成。如中国科技大学祁超等以UTP、葡萄糖-1-磷酸为底物，通过大肠杆菌表达 的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶合成M)PG，转化率在65?85%[中国科技大学学报，2004， 34 (5)，624-629]。日本Yamasa公司采用面包酵母生产UDPG，转化率只有28%[US5968783]。 日本东京大学研究者Hiroyasu Kawai采用白球拟酵母生产UDPG，转化率在65%，但是会伴 随产生部分M)P-Gal，两者很难分离。Agnes W.H. TAN利用纯的己糖激酶、磷酸葡萄糖变 位酶、UDPG焦磷酸化酶、焦磷酸化酶合成UDPG，转化率在85%[Biochimica et Biophysica Acta，582 (1979) 543-547]，但是用纯酶价格比较高，也限制了其工业化生产使用。
[0006] 由于UTP价格昂贵，大多数研究者都利用价格便宜的UMP合成UTP。主要是通 过表达核苷酸磷酸激酶的大肠杆菌系统来生产UTP。这需要克隆至少四到六个酶，使 得UTP的合成途径繁琐，成本下降不明显。日本Yamasa公司利用酵母系统生成UTP与 UDPG的混合溶液，再在大肠杆菌表达的UDPG焦磷酸化酶和麦芽糊精磷酸化酶作用下生成 UDPG [US6040158]。但其利用酵母系统合成UTP和UDPG的过程中，会产生一定量的UDP-Gal， 而UDPG和UDP-Gal之间很难分离，加重了后续分离工艺的负担。
[0007] 综合以上因素，本领域迫切需要进一步开发高效低成本生产UDPG的新方法。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG)的制备方法。
[0009] 在本发明的第一方面，提供一种制备尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG)的方法，所述方法 包括：在一个体外（细胞外）反应系统中，以尿苷三磷酸（UTP)或其盐（如钠盐）、麦芽糊 精为底物，加入无机离子、dTT和Tris，以大肠杆菌重组表达的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化 酶和麦芽糊精磷酸化酶作为催化剂，通过生物转化生产尿苷二磷酸葡萄糖。
[0010] 在一个优选例中，所述的尿苷三磷酸或其盐（如钠盐）如下制备：
[0011] 将尿苷一磷酸或其盐（如钠盐）、酵母、无机盐和碳源混合、反应，获得尿苷三磷酸 或其盐（如钠盐）。
[0012] 在另一优选例中，所述的酵母经过通透性处理，使得酵母与外界的物质交换更为 通畅。
[0013] 在另一优选例中，所述的无机离子包括阳离子和阴离子；较佳地，所述的阳离子 选自：镁离子、钾离子或钠离子；所述的阴离子是磷酸根离子；更佳地，所述的无机离子由 磷酸二氢钾、硫酸镁产生；较佳地，所述的磷酸二氢钾的终浓度为15± 10g/L(更佳地为 15±8g/L ;更佳地为15±5g/L);较佳地，所述的硫酸镁的终浓度是2. 5±lg/L(更佳地为 2. 5±0. 5g/L ;更佳地为 2. 5±0. 2g/L);
[0014] 所述的碳源选自：葡萄糖、果糖或蔗糖；较佳地是葡萄糖；所述的葡萄糖的终浓度 是15±10g/L(更佳地为15±8g/L ;更佳地为15±5g/L);
[0015] 所述的尿苷一磷酸或其盐（如钠盐）的终浓度是30±15g/L (更佳地为30±10g/ L;更佳地为30±5g/L);
[0016] 所述的酵母的终浓度是180±100g/L (更佳地为180±60g/L ;更佳地为180±20g/ L)。
[0017] 在另一优选例中，以大肠杆菌重组表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的方法包 括：
[0018] (1)提供重组表达载体，其中包括尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶编码基因 galU(其与驱动表达的元件如启动子操作性连接）；
[0019] (2)将（1)的重组表达载体转化大肠杆菌BL21，获得重组大肠杆菌BL21 ;
[0020] (3)培养（2)的重组大肠杆菌BL21，从而表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶；较 佳地，重组表达时，当菌株在培养基中0D600达到0. 6时，加入IPTG诱导，IPTG终浓度为 0. 5mM，诱导后继续培养4小时，收集菌体，破碎，分离上清。
[0021] 在另一优选例中，以大肠杆菌重组表达的麦芽糊精磷酸化酶的方法包括：
[0022] (a)提供重组表达载体，其中包括麦芽糊精磷酸化酶编码基因 malp (其与驱动表 达的元件如启动子操作性连接）；
[0023] (b)将（a)的重组表达载体转化大肠杆菌BL21，获得重组大肠杆菌BL21 ;和
[0024] (c)培养（b)的重组大肠杆菌BL21，从而表达麦芽糊精磷酸化酶；较佳地，重组表 达时，当菌株在培养基中0D600达到0. 8时，加入IPTG诱导，IPTG终浓度为0. 4mM，诱导后 继续培养3小时，收集菌体，破碎，分离上清。
[0025] 在另一优选例中，所述反应系统中，尿苷三磷酸或其盐（如钠盐）的终浓度为 l〇±5g/L(更佳地为10±3g/L;更佳地为10±2g/L);或
[0026] 麦芽糊精的终浓度为22±10g/L (更佳地为22±6g/L ;更佳地为22±3g/L);或
[0027] 大肠杆菌重组表达的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的终浓度1?50ml/L(相当于 0. 5-25g菌体）（更佳地为1?30ml/L(相当于0. 5-15g菌体）；更佳地为1?lOml/L(相 当于0. 5-5g菌体））；
[0028] 大肠杆菌重组表达的麦芽糊精磷酸化酶的终浓度1?50ml/L(相当于0. 5_25g菌 体）（更佳地为1?30ml/L(相当于0· 5-15g菌体）；更佳地为1?10ml/L(相当于0· 5-5g 菌体））；
[0029] 所述的