检测水稻高粒重等位基因的特异性pcr分子标记的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及水稻育种中的检测技术领域，特别是检测水稻粒重QTL qTGWl.2a^WqTGWl.上密阳46高千粒重等位基因的8个特异性PCR标记。
【背景技术】
[0002]目前，世界人口的增长速率高于粮食增产速率，食物短缺已成为全球性安全问题。水稻作为世界上一半人口的主食，提高其产量对解决粮食安全问题具有重大意义。水稻的增产在经历了矮杆化和杂种优势利用之后，一直处于缓慢增长状态，近30年我国水稻新品种产量年提高幅度仅为1_2%，其中部分类型甚至低于1%。在该缓慢增产阶段，千粒重对产量提高发挥了至关重要的作用。因此，在水稻新品种的选育过程中，千粒重的高低是育种家们关注的焦点之一。高千粒重品种的培育常将需改良的品种和高千粒重的材料进行杂交而获得，千粒重的测定需等种子完全成熟后测量较为精确，且选育过程中待测样本数量庞大，阻碍了育种进程以及加大育种成本。随着分子标记的快速发展，借助分子标记辅助选择，利用合适的分子标记能在水稻全生育期鉴定对千粒重起增效作用的等位基因在受体品种中的导入，从而从后代中选育出高千粒重的水稻品种。目前，分子标记辅助选择技术已经在水稻抗病性，抗虫性以及耐盐等性状广泛应用。
[0003]申请人前期在水稻第I染色体上定位到3个控制水稻千粒重的QTUWang L-L, etal.Dissect1n of qTGWl.2 to three QTLs for grain weight and grain size in rice(Oryza sativa L.).Euphytica, DOI 10.1007/sl0681-014-1237_7)。在这 3 个QTL 区间，来源于水稻品种密阳46的等位基因均具有提高千粒重的作用，而定位精度则以qTGWl.2a和qTGWl.2b为高。本发明在此基础上，根据水稻品种密阳46和珍汕97的重测序结果，针对qTGWl.2am qTGWl.所在区间进行序列比对，设计序标位(STS)标记，并从中挑选出可特异性鉴定密阳46等位基因的标记。本发明提供的分子标记对水稻粒重QTL qTGWl.2a^qTGWl.上密阳46增效等位基因的检测具有普遍应用价值，可以广泛地应用于qTGWl.2a和qTGWl.上密阳46增效等位基因的转育研究中。
【发明内容】
[0004]本发明解决的技术问题是提供了检测qTGWl.為和qTGWl.上密阳46高千粒重等位基因的特异性分子标记8个，其中，检测qTGWl.為的7个，检测qTGWl.%的I个。
[0005]本发明采用以下技术方案:根据密阳46和珍汕97的重测序结果，对qTGWl.2a$\
在区间及其紧密连锁区间的序列进行比对，根据插入和缺失情况，在该区段设计了 12个STS标记，经实验室鉴定验证，筛选出8个在两个品种中具有多态性的标记。
[0006]用于检测qTGWl.為上密阳46高千粒重等位基因的标记有7个，分别命名为Wn32837、Wn32886、Wn32893、Wn33185、Wn33186、Wn33304b 和 Wn33252，具体序列如下:
Wn32837的上游引物序列为5’ - CGTCCTGCGTTTCGACATGACT-3’，所述核苷酸序列为SEQID NO:1所示的核苷酸序列； Wn32837的下游引物序列为5’ - TATTTCTACCACTCCAAGCACCA-3’，所述核苷酸序列为SEQID NO:2所示的核苷酸序列；
Wn32886的上游引物序列为5’ - CGTGTTACTAACCCAGTCAACTCAGG-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
Wn32886的下游引物序列为5’ - CAATAGTAGCAGCTAAATTGGCGTTC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列；
Wn32893的上游引物序列为5’ - TTCCGATTTTGTTTTCTTGGTCCC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；
Wn32893的下游引物序列为5’ - GCCGCACATTTATTACCTTAATCCTG-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列；
Wn33185的上游引物序列为5’- GGAGGATAACGCAAGCAAACTTGA-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:7的所示核苷酸序列；
Wn33185的下游引物序列为5’ - CCATAGCTTGTAAAAGACAGTGCC-3’，所述核苷酸序列为SEQ IDN0:8所示的核苷酸序列；
Wn33186的上游引物序列为5’- AGTTAGTGCAGCAATCTACGTCCT-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:9的所示核苷酸序列；
Wn33186的下游引物序列为5’ - AGCTCCTCCAGTGACGATACGG-3’，所述核苷酸序列为SEQIDNO: 10所示的核苷酸序列；
Wn33304b的上游引物序列为5’- AAGCAACATAACTTATTCTACTC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO: 11的所示核苷酸序列；
Wn33304b的下游引物序列为5’ - ACGACATCCACTTCGCACC-3’，所述核苷酸序列为SEQIDNO: 12所示的核苷酸序列；
Wn33252的上游引物序列为5’- GCATGTATCAAAGATTCGATGAGA-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO: 13的所示核苷酸序列；
Wn33252的下游引物序列为5’ - TGAAAACTCATGGCTACGCT-3’，所述核苷酸序列为SEQIDNO: 14所示的核苷酸序列。
[0007]用于检测qTGWl.上密阳46高千粒重等位基因的标记有I个，命名为Wn34526，具体序列如下:
Wn34526的上游引物序列为5’- TCATCATCTGTTCGTGGGTT-3’，所述核苷酸序列为SEQ IDNO: 15的所示核苷酸序列；
Wn34526的下游引物序列为5’ - TTGAAATATAAACTCTATACAATCTGCT-3’，所述核苷酸序列为SEQ IDNO: 16所示的核苷酸序列。
[0008]8个STS标记的PCR扩增体系一致。扩增体系为，Tris-HCL (pH 8.8)33.5 mM,(NH4)2SO4 8.0 mM,MgCl2 1.5 mM, TWEEN-20 0.05%, dNTPs 0.2 mM，上、下游引物各3.3 ng/μ?，Ti^DNA聚合酶2.0单位，模版DNA 50 ng ;PCR反应条件除退火温度外其它一致，预变性温度94°C 2分钟；变性温度94°C 45秒、退火温度50-55°C (Wn33815、Wn33252和Wn34526为50°C，其余5个标记皆为55°C ) 45秒、72°C I分钟，30个循环；72°C 8分钟。
【附图说明】
[0009]图1 STS标记Wn32886的检测结果。
[0010]M:分子量对照；P1:珍汕97 ；P2:密阳46 ；1~16:待测样品图2两套近等基因系两地种植的千粒重分布。
[0011]A.2014年春海南陵水為
B.2014年春海南陵水qTGWl.2b
C.2014年夏浙江富阳776￥7.為
D.2014年夏浙江富阳光。
【具体实施方式】
[0012]以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0013]实施例1水稻千粒重QTL qTGWl.2a热上密阳46特异性分子标记的开发
利用序列比对软件DNASTAR MegAlign模块(Lasergene)对QTL定位群体的亲本珍汕97和密阳46在千粒重QTL qTGWl.為和qTGWl.%所在区间的碱基序列进行比对，根据2个品种在比对中表现出的插入或缺失位点，应用引物设计软件Oligo 7.0开发了 12个分别用于检测qTGWl.2am qTGWl.增效等位基因密阳46特异片段的STS标记。通过下述步骤鉴定这些开发的标记是否在珍汕97和密阳46之间存在特异性，且在分离群体中是否能准确的鉴定出携带密阳46等位基因。本发明以STS标记Wn32886为例详细介绍检测方法:
1.DNA微量提取