用于检测猪流行性腹泻病毒的pcr引物、试剂盒及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及用于检测猪流行性腹泻病毒的PCR引物、试剂盒及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]猪流行性腹湾(Porcine epidemic diarrhea, PED)是一种以猪腹湾、呕吐和脱水为主要特征的急性高度接触性肠道传染病，此病多发于冬季12月至来年2月寒冬季节，在夏季也可发生，尤其哺乳仔猪受害最严重。新生仔猪PED潜伏期为24-36小时。病猪表现呕吐、腹泻和脱水，年龄越小，症状越重，其病原是猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus, PEDV)。
[0003]该病毒最早分离于比利时表现腹泻的猪群，并命名为类冠状病毒CV777株，而后英国、匈牙利、西德、加拿大、日本、韩国等国相继报道有本病的发生。我国自上世纪80年代初开始陆续有猪流行性腹泻的发生，特别是最近3年以来，猪流行性腹泻已成为最重要的猪群疫病，不仅感染面广，而且发病率和死亡率都居高不下，给养猪业带来了巨大的经济损失。鉴于猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎在临床上很难区别，而且PEDV又难以在细胞上增殖和培养，所以，早期诊断对本病的防治具有极其重要的意义，此前，我国尚无PEDV毒株的特异性荧光RT-PCR检测技术，因此建立一种快速，高灵敏度的诊断方法势在必行。
【发明内容】
[0004]本发明目的在于提供用于检测猪流行性腹泻病毒的PCR引物、试剂盒及其制备方法和应用，用于猪流行性腹泻病毒的荧光RT-PCR检测。
[0005]为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现:
用于检测猪流行性腹泻病毒的PCR引物，其特征在于它包括引物SEQ ID No: 1- SEQ IDNo:3:
正向引物 PEDV-NF:5’ -CTTCCCAGCGTAGTTGAGATTGT -3’ ；
反向引物 PEDV-NR:5’ -TTGCCTCTGTTGTTACTTGGAGAT -3’ ；
荧光探针引物 PEDV-NP:5’ -TGTTGCCATTACCACGACTCCTGC -3’。
[0006]这3条引物可以从感染猪流行性腹泻的样品中扩增到122bp的特异性条带，通过荧光PCR仪器可以检测得到。
[0007]本发明与现有技术相比有许多优点和积极效果:本发明通过分析猪流行性腹泻病毒保守的N基因序列，经过一系列比较分析，最终确定了 3条特异性引物，可以用于猪流行性腹泻病毒的荧光RT-PCR检测。本发明经过大量实验证实，利用这三条特异性引物建立的荧光定量RT-PCR能够准确定量、高度敏感和特异性地检测猪流行性腹泻病毒的感染，该技术可用于猪流行性腹泻病毒的流行病学调查、诊断和监测等，在猪流行性腹泻感染早期发挥巨大作用。
【附图说明】
[0008]图1是本发明所述3条引物用于猪流行性腹泻病毒荧光RT-PCR的特异性检测结果，呈现“S”形荧光曲线的样品为猪流行性腹泻病毒；其余呈现平滑曲线的样品是猪传染性胃肠炎病毒(TGVE)、猪轮状病毒(PRoV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以及阴性对照。
[0009]图2是本发明检测方法的灵敏度实验结果。将阳性质粒10倍梯度稀释，从10_￥lJ1-9,以此为模板用本发明中提供的3条特异性引物进行荧光定量PCR，结果表明即使稀释至2.6*10\仍然可以看到典型的“S”形扩增曲线，表明仍可检出PEDV。
【具体实施方式】
[0010]下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。
[0011]实施例1
1.引物设计和合成
本发明所述猪流行性腹泻病毒属于冠状病毒科冠状病毒属，病毒粒子核酸为线性正股单链RNA，整个基因组长约28.6kb。PEDV粒子有4种结构蛋白，为S蛋白(spikeprotein)、sM 蛋白(small membrane protein)、M 蛋白(membrane protein)和 N 蛋白(nucleop1tein)，其中N基因为核蛋白，特性比较保守和稳定，因此本发明利用N基因作为检测PEDV的候选基因，针对PEDV比较保守的N基因区域，采用DNAstar和Primer 5.0软件设计引物，设计了一个TaqMan探针和2条特异性型引物。
[0012]经过大量筛选得到如下序列的弓I物序列:
正向引物 PEDV-NF ( N0.1)5’ -CTTCCCAGCGTAGTTGAGATTGT -3’ ；
反向引物 PEDV-NR (N0.2):5，-TTGCCTCTGTTGTTACTTGGAGAT -3’ ；
荧光探针引物序列:PEDV-NP(N0.3) 5’ -TGTTGCCATTACCACGACTCCTGC -3’。
[0013]这些引物合成后，分别用DEPC水稀释溶解，其中PEDV-NF和PEDV-NR的浓度为20 μ mol/L, PEDV-NP 的浓度为 10 μ mol/L,备用。
[0014]2.本发明还提供了检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，按以下组分组装(20份/盒):
每份成分的含量为:
阴性对照I管
阳性对照I管
无菌DEPC水 I管 RT反应液I管
PCR反应液 I管
检测引物(正向引物、反向引物和荧光引物)各I管使用说明书I份。
[0015]所述阴性对照为:-20°C冰箱保存的灭菌的DEPC水；
所述阳性对照为:
3.本发明所述检测PEDV的荧光RT-PCR检测方法，包括以下步骤: I)样品处理:
按照猪粪便待检测样品与缓冲液重量比为1:5的比例加入PBS缓冲液，5000rpm 4°C离心lOmin，然后吸出上清液用于提取RNA。
[0016]2)提取病毒RNA =RNA的提取根据相关试剂盒的说明书进行，即取粪便悬液250μ?于1.5mL的离心管中，加入75(^LTRIzol，混匀，室温放置5min ;再加入200μ?氯仿，振荡混匀，室温放置1min ; 12000r/min、4°C离心15min，取上清500μ?，加等体积_20°C预冷的异丙醇室温静置1min或-20°C静置30min，12000r/min、4°C离心1min ;弃上清，加入75%冰冷乙醇(DEPC处理水配制)，8000?9000g离心5min ;弃上清，倒置风干，用2(^LDEPC处理水溶解，-20°C冻存备用。
[0017]3)反应体系:按照上述体系进行反应体系的配制，包含以下试剂:
2X1 step Buffer12.5 μ L
20 μ mol/L PEDV-NF I μ L 20 μ mol/L PEDV-NR I μ L 10 μ mol/L PEDV-NP 0.5 μ L