含位点特异非天然氨基酸残基的抗体、其制备和使用方法
【技术领域】
[0001] 本文提供包含在位点特异（site-specific)的位置的非天然氨基酸残基的抗体、 包含所述抗体的组合物、它们的制备方法和它们的使用方法。
【背景技术】
[0002] 抗体是对它们靶抗原具有显著的亲和力的生物分子。自然提供抗体作为某些脊椎 动物中的部分防御系统，用于消除或破坏外源蛋白、细胞和生物体（organisms)。如果对某 脊椎动物提供在例如受感染的细胞或感染性细菌上的外源蛋白，则抗体能够结合它的靶外 源蛋白，以引导该外源实体至消除或破坏该外源实体。
[0003] 人类能够利用抗体的选择性的亲和力来靶向几乎任何所期望的抗原。所述抗原可 以是受感染的细胞或感染性微生物上的蛋白质。它也可以是例如癌细胞上的蛋白质、靶组 织的细胞上的蛋白质、血流中的蛋白质、发炎的或炎性细胞上的蛋白质、或其选择性结合是 有用的的任意其它蛋白质。因此，已发现抗体用于治疗诸如癌症、炎性疾病、自身免疫性疾 病和移植排斥等病症。抗体可以用信号通知免疫系统来破坏或消除病变细胞、或工程抗体 可以携带分子有效载荷来破坏祀标。在某些应用中，治疗性抗体连接到分子屏（molecular shields)，以增加它们在生物体内的寿命。还发现抗体用作诊断工具（diagnostics)。这些 抗体可以携带标记物，以指示在细胞上或组织中的靶抗原。这些标记物通常通过共价键与 抗体连接。
[0004] 迄今为止，用于连接抗体、分子实体（诸如分子有效载荷、分子屏和标记物的技术 受限于它们连接到抗体的程度和位置的不均一性、受限于它们的低收率、以及受限于活性 的降低。通常的偶联（conjugation)位点包括抗体链上的随机位置,例如，氨基酸侧链上 的随机的胺和某些抗体链的N末端。在这样的技术中，一些抗体可能在一个位置连接到偶 联物（conjugate)，而一些抗体在另一位置连接相同的偶联物，一些抗体可能根本不进行连 接。
[0005] 需要在位点特异的位置被修饰以针对均匀性、收率和/或活性进行优化的抗体， 以促进抗体在例如治疗和诊断中的有前景的应用。
【发明内容】
[0006] 本文提供在一个或多个位点特异的位置用一个或多个非天然氨基酸残基修饰的 抗体。这些位点特异的位置对于用非天然氨基酸残基置换天然氨基酸残基是最佳的。在某 些实施方案中，在这些位点特异的位置的置换产生置换均匀的（即，实质上在所选的位置 中经修饰的）抗体。在某些实施方案中，在一个或多个这些位点特异的位置经置换的抗体 具有有利的产品收率、有利的溶解度、有利的结合性和/或有利的活性。在以下的部分中详 细描述了这些抗体的所述特性。
[0007] 在一方面中，本文提供包括多肽的抗体，所述多肽在所述多肽链中的最佳可置换 的位置具有至少一个非天然氨基酸残基。对本领域技术人员而言，所述抗体可以是被公认 为抗体的任意多肽或多聚体多肽。所述多肽链可以是所述抗体的任意多肽链，包括任意重 链和任意轻链。所述多肽链中的最佳可置换的位置是所述多肽链中的能够提供具有最佳收 率、均匀性、溶解度、结合性和/或活性的置换的任意位置。以下的部分详细描述了这样的 多肽链的最佳可置换的位置。以下还描述了有用的抗体、有用的非天然氨基酸。
[0008] 在另一方面中，本文提供保护所述抗体的组合物。有利地，由于本文所提供的抗体 的置换的均匀性，这样的组合物可以具有高的均匀性。在某些实施方案中，在以蛋白质的总 重进行测量时或在以抗体的总重进行测量时，所述组合物包含实质量的所述抗体。在某些 实施方案中，所述组合物以重量计包含至少80%的所述抗体、至少85%的所述抗体、至少 90%的所述抗体、或至少95%的所述抗体。
[0009] 在另一方面中，本文提供制备所述抗体的方法。所述抗体可以由对本领域技术人 员而言是显而易见的、用于将非天然氨基酸并入抗体链的位点特异的位置的任意技术来制 备。在某些实施方案中，所述抗体通过固相合成、半合成、活体内翻译、体外翻译或无细胞翻 译而制备。
[0010] 在另一方面中，本文提供使用所述抗体用于治疗的方法。根据本文的描述，针对治 疗靶点的抗体可以并入一个或多个位点特异的非天然氨基酸。这些抗体可以用于治疗或预 防与所述治疗靶点相关的疾病或病症。有利地，位点特异的非天然氨基酸可以用于将所述 抗体连接到治疗性有效载荷（therapeutic payload)，以促进疗效。本文详细描述了示例性 抗体、治疗靶点和疾病或病症。
[0011] 在另一方面中，本文提供使用所述抗体用于检测的方法。根据本文的描述，针对检 测靶点的抗体可以并入一个或多个位点特异的非天然氨基酸。这些抗体可以与标记物一起 使用，以用信号通知与检测靶点的结合。有利地，位点特异的非天然氨基酸可以用于将所述 抗体连接到标记物，以促进检测。本文详细描述了示例性抗体、检测祀点和标记物。
[0012] 在另一方面中，本文提供改善（modifying)抗体稳定性的方法。抗体可以用如本 文所描述的非天然氨基酸进行改性，以促进连接到能够改性所述抗体的稳定性的分子实 体。例如，位点特异性的非天然氨基酸可以促进连接到分子屏，例如聚乙二醇，以增加抗体 的稳定性。本文描述了示例性非天然氨基酸和连接部分。
【附图说明】
[0013] 图1提供了示例性细胞毒试剂DBC0-MMAF。
[0014] 图2提供了单峰疏水作用层析（HIC)测定轮廓曲线（profile)。
[0015] 图3提供了没有精确解析的（not-well-resolved) (NWR)HIC测定曲线。
[0016] 图4提供了精确解析的（WR)HIC测定曲线。
[0017] 图5A和5B描述了两个变体（HC TllO和HC Sl 12))的示例性HIC痕迹（traces)， 显示了对应于非偶联的、部分偶联的和完全偶联的IgGs的峰。
[0018] 图6A-6E描述了显示位点特异性的偶联（conjugation)的示例性实施方案。
[0019] 图7A和7B描述了包含不同的非天然氨基酸的抗体的抑制效率和可溶解的量 (soluble yield)的对比数据。
[0020] 图8描述了示例性的贝伦妥单抗（brentuximab)抗体药物偶联物对⑶-30阳性细 胞系的细胞杀伤。
[0021] 图9提供了证明示例性的贝伦妥单抗抗体药物偶联物不能杀死不表达CD-30的细 胞的实验结果。
[0022] 图10描述了示例性的贝伦妥单抗（ADCETRIS?)抗体药物偶联物与⑶-30阳 性细胞系的结合。
[0023] 图11A、11B、11C和IlD分别提供了示例性的细胞毒试剂DBCO-MMAF 2、DBC0-DM4、 DBC0-DM42 和 DBC0-MMAE 的结构。
[0024] 图12提供了示例性scFv-Fc位点特异性的抗体药物偶联物的药代动力学的图示。
[0025] 图13A和13B描述了示例性的位点特异性的抗体药物偶联物在动物模型中阻碍肿 瘤生长和/或退化（regress)肿瘤尺寸的活体内的效力。
【具体实施方式】
[0026] 本文提供在一个或多个位点特异性的位置具有非天然氨基酸的抗体、包含所述抗 体的组合物、制备所述抗体的方法和它们的使用方法。
[0027] 定义
[0028] 当提及本文所提供的抗体时，下列术语具有以下含义，除非另有说明。除非另有定 义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员所通常理解的相同的 含义。如果对于本文的术语有多个定义，以该部分的定义为准，除非另有说明。
[0029] 如本文所使用的，单数形式"a"、"an"、和"the"包括复数的提及，除非上下文明确 地另有说明。因此，例如，提及"抗体"是提及一个或多个这样的抗体等。
[0030] 对于包含抗体的组合物，术语"实质上纯的"是指组合物以重量计（例如干重）包 含至少80%、85%、90%、或95%，在某些实施方案中，95%、98%、99%、或100%的相对于 所述组合物的剩余部分的抗体。重量百分比可以相对于所述组合物中的蛋白质的总重或相 对于所述组合物中的抗体的总重。纯度可以通过对本领域技术人员而言是显而易见的技术 (例如SDS-PAGE)来测定。
[0031] 术语"分离的（isolated)"是指实质上或基本上没有如在抗体的天然存在的环境 或它的生产环境中，或这两种环境中所发现的、通常伴随着所述抗体或与所述抗体相互作 用的组分的抗体。分离的抗体的制剂（Pr印arations)以重量计（例如干重）具有小于约 30 %、小于约25 %、小于约20 %、小于约15 %、小于约10 %、小于约5 %、小于约4 %、小于约 3%、小于约2%、小于约1 %的污染蛋白质。
[0032] 术语"抗体"是指本领域技术人员所公认为是抗体的任意大分子。抗体共享常见 的性质，包括结合（binding)和至少一个多肽链，所述多肽链与能够由本领域技术人员所 公认的任意的免疫球蛋白基因所编码的多肽链实质上是相同的。所述免疫球蛋白基因包括 但不限于κ、λ、a、 Y (IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因、以及免疫球 蛋白可变区基因。该术语包括本领域技术人员所公认的全长的抗体和抗体片段，以及它们 的变体。该术语进一步包括糖基化的和非糖基化的（aglycosylated)抗体。
[0033] 术语"抗体片段"是指除全长形式之外的任意形式的抗体。本文的抗体片段包括存 在全长抗体内的为更小的组分的抗体、和已经被工程化的抗体。抗体片段包括但不限于Fv、 Fe、Fab、和（Fab'）2、单链Fv (scFv)、双体、三体、四体、双功能的杂交抗体、CDRl、CDR2、CDR3、 CDR's 的组合、可变区、构架区、恒定区等（Maynard&Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76 ;Hudson，1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402)。
[0034] 术语"免疫球蛋白（Ig) "是指由一种或多种实质上由免疫球蛋白基因中的一种 所编码的多肽所组成的蛋白质，或是指氨基酸序列与其实质上相同的蛋白质。免疫球蛋白 包括但不限于抗体。免疫球蛋白可以具有许多结构形式，包括但不限于全长抗体、抗体片 段和包括但不限于V H、Cy 1、C γ 2、C γ 3、'和C1的个别免疫球蛋白域（immunoglobulin domain)〇
[0035] 术语"免疫球蛋白（Ig)域"是指由实质上由免疫球蛋白基因所编码的多肽组成的 蛋白质结构域（protein domain)。Ig域包括但不限于VH、CyUCy 2、C γ 3、V1^P C ^
[0036] 术语抗体的"可变区"是指由VhS疫球蛋白域、V ^免疫球蛋白域、或Vh和八免疫球 蛋白域所组成的多肽。可变区可以是指分离的这个或这些多肽，如Fv片段、如scFv片段、 如在更大的抗体片段环境中的该区、或如在全长的抗体片段或替代性的非抗体骨架分子环 境中的该区。
[0037] 术语"可变"是指这样的事实：抗体之间的可变区的某些部分的序列是普遍不同 的，其是各个特定的抗体对它的特定的抗原的结合特异性的原因。然而，可变性并不是遍 及抗体的可变区均匀分布的。在轻链和重链可变区中，它都集中在被称为互补性决定区 (CDRs)的三个区段中。可变区的更高度保守的部分被称为构架区（FR)。天然的重链和轻链 的可变区各包含四个FR区，所述四个FR区基本上采用β -折叠构型，通过三个或四个⑶R 进行连接，