大麦Hvsusiba2基因在降低水稻田甲烷释放的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及尤麦々KSMi知2基因在降低水稻田甲烷释放的应用，具体为一个大麦 转录因子提高降低水稻甲烷释放量方面的应用。
【背景技术】
[0002] 甲烧（CH4)是重要的温室气体之一，其排放的总量虽然不及C02，但其高于C02 21-25倍的增热效率使其产生的温室效应倍受关注。研究显示：水稻田是大气014的重要排 放源，约占全球人为总排放的12%_26%。中国是水稻种植大国，近20年平均种植面积和产量 分别占全球的20%和31%。水稻田甲烷释放对温室效应的影响受到多方关注，在1987-2011 年间，仅中文期刊发表的有关文献超过200篇，从不同角度研究水稻田甲烷释放的影响因 素。
[0003] 稻田甲烷生成的底物碳是来源于水稻光合作用产物，光合产物向根部转运，分解 为二氧化碳、氢、甲酸、乙酸等甲烷生物合成的底物，在稻田复杂的植物和微生物互作过程 中，淹水环境促进了微生物的厌氧发酵，这些微生物利用水稻生长过程中向土壤释放的碳 源，经过一系列分解作用，最后生成甲烷。向大气排放的甲烷是土壤中厌氧微环境甲烷还原 过程和有氧微环境甲烷消耗过程的平衡后的净值。
[0004] 稻田甲烷释放的直接原因是微生物、土壤微环境以及作物品种互作的结果。所有 影响微生物、土壤环境以及作物品种的因素都能间接地影响稻田甲烷的生产和释放。因此， 稻田甲烷的释放是极其复杂的多因素综合作用的结果。多年来，研究者们采用了许多策略 降低稻田甲烷释放量，如拷田、更换品种、改变施肥方式等，但收效有限，且无法大面积推广 使用。降低稻田甲烷释放已成为全世界关注的热点和难点。以改变水稻品种为切入点是从 源头上减低甲烷产生和释放的最经济、最有效的方法。现代分子生物学技术可以通过分子 操作手段到达修饰植物的目的，如敲除基因删除生物的不利性状，插入整合一个片段增加 生物没有的新性状，还可以通过大片段整合或替代，将整个代谢途径转移到原来没有的生 物中。本发明通过转基因技术调控水稻体内碳分布方式，增加植株地上部的光合同化碳分 配，降低植株地下部的光合同化碳分配，达到提高产量，降低稻田甲烷释放的目的。为通过 分子操作改良作物品种提供了新的思路。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供尤麦你知2基因在降低水稻田甲烷释放的应用，构建 了植物载体P必在水稻籽粒中异源表达知連因；转基因水稻甲烷 释放量显著下降。本研究结果对降低水稻的甲烷释放，减少温室效应具有及其重要意义。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 大麦"KSMi知連因在降低水稻田甲烷释放的应用。通过在水稻籽粒中异源表达大麦WRKY转录因子基因现。
[0007] -种过表达//KsysiAa?因的载体。所述载体为启动子驱动的 基因序列的pieJJ/?- 体。
[0008] -种降低水稻甲烷释放量的方法，通过在水稻籽粒中异源表达々Kski知续现。
[0009] 所述知連因，基因编号为AY323206. 1，基因全长2354bp，其中编码区 1722bp，编码573个氨基酸，基因序列如SQEIDNO. 1所示。
[0010] 所述异源表达是构建特异性植物表达载体p 其构建过程 是：用历II和 5^1 分别双酶切中间载体pGEM-3Z-5^<9iT6和pl301 -ubiquitin，"^收pGEM-3Z-5^<9iT^中的启动子，用启动子替代pl301_ 中的 得到pl301-5^<9i7^中间载体；再用 5)9(91 酶切pl301-5^<9i76,用//ifloIII和Aal双酶切pMOSBLlue载体上的知連因片段，回收后分别补平，将pMOSBLlue中 的//Ksisi知正向连接到p13 01 -仰知/功的后面，获得psAeJJ/?- Aa么将转化载体 导入农杆菌菌株LBA4404,获得p LBA4404工程菌。
[0011] 所述水稻籽粒中异源表达//Ksisiha?因是借助农杆菌介导法获得转 基因水稻；通过自交分离筛选获得表达大麦//KSki知連因的纯合株系。
[0012] 转化包括以下步骤： 1) 种子消毒和愈伤诱导 2) 工程菌 制备 3) 侵染及共培养 4) 抗性愈伤筛选 5) 抗性愈伤分化、幼苗生根。
[0013] 转基因小苗移栽、检测、筛选出知連因整合且在籽粒中表达的株系，通过 自交重组及进一步的分子检测和筛选，获得转基因纯合株系。
[0014] 本发明构建了pie/JA-达载体，在水稻籽粒中异源表达 基因，转基因水稻地上部生物量显著增加，地下部生物量显著减少；穗长和穗粒数显著增 力口；抽穗期甲烷释放量比对照下降约3倍，花后28天甲烷释放量比对照下约10倍。
[0015] 本发明的有益效果如下： 1.本发明提供了一种因的在降低水稻甲烷释放的新应用方法。发明人 将转基因技术与稻田生态研究技术结合，获得籽粒特异性表达大麦转录因子知攻R 稻；转基因水稻抽穗期甲烷释放量比对照下降约3倍，花后28天甲烷释放量下降约10倍。 本发明对于降低水稻田的甲烷释放量，减少稻田的温室效应具有极其重要的意义。
[0016] 2.本发明通过在水稻籽粒中特异性表达大麦转录因子//Ksisiha么改变了水稻生 物量，地上部生物量显著增加，地下部生物量显著下降。平均穗粒数显著增多，籽粒中淀粉 含量提高。本发明通过增加光合产物向穗部分配，减少光合产物向地下部运输，提高水稻产 量，降低甲烷释放。
[0017] 3.本发明通过转基因调控水稻体内碳分布方式，达到提高产量，降低稻田甲烷释 放的目的，为通过分子操作改良作物品种提供了新的思路。
【附图说明】
[0018]图1. pieiT^-体不意图。
[0019] 图2.转因水稻结实期植株表型。其中A为非转基因对照水稻，B为 转基因水稻； 图3. 2个转基因水稻外源基因插入拷贝数分析。
[0020] 图4.转基因水稻部分农艺性状分析。
[0021] 图5.转知連因水稻地上部与地下部生物量。
[0022] 图6.转知連因水稻田甲烷释放量测定。
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