pHAb-FAST人源抗体表达载体系统及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及pHAb-FAST人源抗体表达载体系统及其使用 方法。
【背景技术】
[0002] 随着基因重组技术，杂交瘤技术以及PCR技术的成熟，单克隆抗体药物的产生成 为可能。自1986年第一种单克隆抗体药物Orthoclone Okt3上市至今的短短25年间， 已有35种单克隆抗体药物相继批准上市，其治疗领域涵盖了 20多种疑难重症，在有效 缓解和治疗疾病的同时也为各制药公司赚取了巨额利润。据医药领域权威预测公司MS health公司的预测，到2016年，全球销售排行前50的药物中单克隆抗体类药物将占11 个，而在前10名中，单抗药物将占据6个席位，分别是排名第一位的Humira(adalimumab)， 排名第二位的 Avastin(bevacizumab)，排名第 4 位的 Rituxan(rituximab)，排名第 6 位 的 Herceptin (trastuzumab)，排名第 7 位的 Remicade (inf liximab)以及排名第 10 位的 Prolia(denosumab)。在肿瘤治疗领域，销售额排名前5的药物中单抗类药物将占据4个 席位，分别是 Avastin (bevacizumab)，Rituxan (rituximab)，Herceptin (trastuzumab) 和Erbitux (cetuximab)。在抗风湿病领域的前5名药物中，单抗药物亦将占有4 个席位：Humira(adalimumab)， Remicade(infliximab)， Simponi(golimumab)， 和 Actemra(tocilizumab)。由此可见，单克隆抗体药物已经成为生物技术药物领域中的新秀， 随着新靶点的不断引入，单克隆抗体药物的治疗领域也将进一步扩大，单克隆抗体的开发 越来越受到各国科学家和各大知名药厂的关注和青睐。
[0003] 另外，从25年的上市单抗药物的类型来看，单克隆抗体药物经历了由鼠源抗体到 嵌合抗体到人源化抗体到全人抗体的演变，随着这种演变的发生，其治疗效果有了明显的 提高，副作用有了显著降低。所以，含有人抗体恒定区的抗体类型（嵌合抗体/人源化抗体 /全人抗体）将成为今后单克隆抗体药物的主流。
[0004] 单克隆抗体药物的产生的过程中均需要构建特定抗体的表达载体或是抗体库。无 论是经过噬菌体展示技术产生的优化抗体片段（Fab、scFv)，还是通过哺乳动物细胞展示技 术筛选全长抗体，均需要将抗体的轻链可变区和重链可变区与人抗体的恒定区相连并确保 正确表达和顺利分泌。到目前为止，虽然有多种商业化的表达载体，但是针对人源抗体分子 构建的可用载体很少，而且现有的表达载体均为单质粒系统且需要通过多次酶切连接才能 够在同一表达载体上同时表达两种成分（如抗体重链和抗体轻链），构建步骤繁琐，时间耗 费长，至今无商业化的高效人源抗体表达载体系统可供选用。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高效的人源抗体表达载体 系统。运用本发明的所述表达载体系统，借助重叠PCR扩增技术，无需酶切连接过程，即可 高效快速地获得具有表达功能的人源抗体表达载体；通过所获得的人源抗体表达载体可在 哺乳动物细胞内高效表达全长抗体。
[0006] 本发明第一方面公开了一种pHAb-FAST人源抗体表达载体系统，包括pHAb-FAST 1载体和pHAb-FAST 2载体，所述pHAb-FAST 1载体包含依次排列的EF1 a启动子，人抗体 轻链信号肽序列和人抗体重链恒定区序列；所述pHAb-FAST 2载体包含依次排列的人抗体 轻链恒定区序列、IRES序列和人抗体重链信号肽序列。
[0007] 优选的，所述pHAb-FAST 1载体中，EF1 a启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所 不〇
[0008] 优选的，所述PHAb-FAST 1载体中，人抗体轻链信号肽序列的核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示。
[0009] 优选的，所述pHAb-FAST 1载体中，人抗体重链恒定区序列的核苷酸序列为如SEQ ID NO :5 所示。
[0010] 进一步的，所述pHAb-FAST 1载体中，还包括基本真核表达载体所需的转录终止 信号（P〇lyA尾）、抗氨苄青霉素抗性基因及大肠杆菌DNA复制基本元件。
[0011] 优选的，所述pHAb-FAST 2载体以T载体形式存在。
[0012] 优选的，所述pHAb-FAST 2载体中，人抗体轻链恒定区序列的核苷酸序列如SEQ ID NO :6所示。
[0013] 优选的，所述pHAb-FAST 2载体中，IRES序列的核苷酸序列为如SEQ ID NO :7所 不〇
[0014] 优选的，所述pHAb-FAST 2载体中，人抗体重链信号肽序列的核苷酸序列如SEQ ID NO :8所示。
[0015] 优选的，所述pHAb-FAST 1载体的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示；所述 pHAb-FAST2载体核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0016] 优选的，所述pHAb-FAST 1载体和pHAb-FAST 2载体共同构成pHAb-FAST人源抗 体表达载体系统。
[0017] 本发明第二方面公开了前述pHAb-FAST人源抗体表达载体系统的制备方法，可采 用本领域技术人员公知的常规方法来制备。
[0018] 本发明第三方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括前述前述pHAb-FAST人源抗 体表达载体系统。
[0019] 进一步优选的，所述试剂盒还包括引物对1。
[0020] 优选的，引物对1是反向PCR引物，用于将pHAb-FAST 1载体的人抗体轻链信号肽 序列和人抗体重链恒定区序列之间打开。
[0021] 更优选的，引物对1包括引物对1正向引物和引物对1反向引物，所述引物对1正 向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :9所示，具体为：
[0022] 5'-GCCTCCACCAAGGGCCCATC-3'。
[0023] 所述引物对1反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO : 10所示，具体为：
[0024] 5,-ACATCTGGCACCTGGGAGCCAG-3, 。
[0025] 进一步优选的，所述试剂盒还包括引物对2。
[0026] 引物对2用于从pHAb-FAST 2载体中获取包含人抗体轻链恒定区序列、IRES序列 和人抗体重链信号肽序列的特定片段。
[0027] 优选的，引物对2包括引物对2正向引物和引物对2反向引物，所述引物对2正向 引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :11所示，具体为：5' -CGAACTGTGGCTGCACCATC-3'。
[0028] 所述引物对2反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :12所示，具体为： 5'-GGAGTGGGCACCTGTTGCTG-3' 。
[0029] 进一步优选的，所述试剂盒还包括用于制备引物对3的核苷酸序列。
[0030] 优选的，引物对3包括引物对3正向引物和引物对3反向引物。
[0031] 优选的，引物对3具有扩增待用抗体轻链可变区序列的功能。另外，引物对3的正 向引物还具有在待用抗体轻链可变区序列5'端添加与人抗体轻链信号肽序列3'端相重叠 的序列的功能，引物对3的反向引物还具有在待用抗体轻链可变区序列3'端添加与人抗体 轻链恒定区序列5'端相重叠的序列的功能。
[0032] 所述引物对3正向引物的设计方法为：在用于扩增待用抗体轻链可变区的正向引 物的5'端添加如SEQ ID NO :13所示的核苷酸序列（5' -CTGGCTCCCAGGTGCCAGATGT-3'），形 成长度为42bp?52bp的引物对3正向引物。
[0033] 所述引物对3反向引物的设计方法为：在用于扩增待用抗体轻链可变区的反向引 物的5'端添加如SEQ ID NO :14所示的核苷酸序列（5' -GATGGTGCAGCCACAGTTCG-3'），形成 长度为40bp?50bp的引物对3反向引物。
[0034] 进一步优选的，所述试剂盒还包括用于制备引物对4的核苷酸序列。
[0035] 优选的，引物对4包括引物对4正向引物和引物对4反向引物。引物对4具有扩 增待用抗体重链可变区序列的功能。另外，引物对4的正向引物还具有在待用抗体重链可 变区序列5'端添加与人抗体重链信号肽序列3'端相重叠的序列的功能，引物对4的反向 引物还具有在待用抗体重链可变区序列3'端添加与人抗体重链恒定区序列5'端相重叠的 序列的功能。
[0036] 所述引物对4正向引物的设计方法为：在用于扩增待用抗体重链可变区的正向引 物的5'端添加如SEQ ID NO :15所示的核苷核酸序列（5' -CAGCAACAGGTGCCCACTCC-3'），形 成长度为40bp?50bp的引物对4正向引物。
[0037] 所述引物对4反向引物的设计方法为：在用于扩增待用抗体重链可变区的反向引 物的5'端添加如SEQ ID NO :16所示的核苷酸序列（5'-GATGGGCCCTTGGTGGAGGC-3'），形成 长度为40bp?50bp的引物对4反向引物。
[0038] 进一步优选的，所述试剂盒还包括末端引物对。
[0039] 优选的，末端引物包括末端引物正向引物和末端引物反向引物。
[0040] 优选的，所述末端引物正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :17所示，具体为： 5'-CTGGCTCCCAGGTGCCAGATGT-3'。所述末端引物反向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:18 所示，具体为：5' -GATGGGCCCTTGGTGGAGGC-3'。
[0041] 进一步的，所述试剂盒还可以包括使用该人源抗体表达系统时可能需要使用的任 何试剂和细胞（如感受