重组系统的制作方法【专利说明】重组系统发明领域[0001]本发明涉及在靶位点进行重组的方法。所述方法还涉及根据在体内进行的本发明方法制备的细胞。[0002]发明背景[0003]不同的细胞类型可以用于不同的工业目的。例如哺乳动物细胞系用于抗体生产；真菌细胞是生产多肽和次级代谢物的优选生物；细菌细胞优选用于小的代谢物和抗体的生产；植物细胞优选用于口味和风味化合物。[0004]重组技术广泛用于这样的细胞和/或使用这样的细胞的方法的生产力的最优化。这可涉及大量的选择，包括但是不限于过表达感兴趣的基因，竞争途径的缺失或失活，改变酶的区室化（compartmentalization)，增加蛋白或代谢物分泌，增加细胞器含量(organellecontent)等。[0005]就丝状真菌而言，可获得的可选择标记有限使新细胞系的构建复杂化。典型地，靶序列在体外被改变以产生带有插入的抗生素抗性标记的突变等位基因。然而，鉴于大规模使用携带抗性基因的生产菌株将这种基因扩散到生物圈的潜在风险，大多数国家的监管机构反对使用抗生素抗性标记。此外，适用于丝状真菌的可选择标记数量有限。[0006]因此，可需要除去可选择标记基因以使生产菌株可以在商业上使用和/或以使同样的标记基因可以在连续的菌株修饰中再循环利用。[0007]发明概沭[0008]本发明涉及在例如祀基因组内在祀位点（targetlocus)或多个祀位点（targetloci)进行重组的方法。本发明所述的重组方法导致靶位点的改变，例如在靶位点插入核酸序列。可实施所述的方法以使在靶位点插入新的序列并伴随从靶位点除去现存的序列。也就是说，所述方法可被用于将靶位点上的序列替换为替代性序列。所述方法可方便地在宿主细胞体内实施。[0009]典型地，当在体内实施时，不对人类或动物细胞实施本发明所述的方法。也就是说，典型地不以治疗方法的形式实施本发明所述的方法。可以离体或体外方式实施本发明所述的方法。术语离体或体外应被理解为包括对微生物（对完整活细胞或非细胞物质二者）实施的方法，但排除对人类或动物实施的方法。[0010]典型地，实施所述方法使至少部分插入在靶位点的序列随后被移除。如果实施所述的方法以在靶位点替换序列并随后移除插入的序列，那么结果可以是使靶位点的序列缺失。[0011]因此，可实施本发明所述的方法以改变靶位点的序列。这种改变可以是，例如添加新的序列、置换现存的序列和/或缺失/去除现存的序列。[0012]典型地，本发明在宿主细胞体内进行。宿主细胞可以优选地是生产感兴趣的化合物的细胞。宿主细胞可以在应用本发明方法之前能够生产感兴趣的化合物。在这种情况下，本发明的方法可以用于修饰靶位点以使通过宿主细胞的感兴趣的化合物的生产改变，例如可以增加产量。或者，宿主细胞可以是由于应用本发明的方法而生产感兴趣的化合物的细胞。[0013]因此根据本发明，提供了在靶位点进行重组的方法，该方法包括：[0014]-提供两种或更多种核酸，它们总共包含：（a)能够与靶位点侧翼序列同源重组的序列；(b)两个或更多个位点特异性重组位点；（c)编码识别位点特异性重组位点的重组酶的序列；和（d)编码标记的序列，[0015]其中所述两种或更多种核酸能够相互同源重组从而产生单一核酸，并且[0016]其中所述两种或更多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分标记基因的序列；以及[0017]-使所述两种或更多种核酸相互重组以及与靶位点的侧翼序列重组，以在靶位点插入编码有功能标记和/或必需基因（essentialgene)的连续核酸序列以及编码重组酶的序列，所述编码标记和/或编码重组酶的序列的侧翼是至少两个位点特异性重组位点以及所述位点特异性重组位点的侧翼是能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列。[0018]因此，所述两种或更多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分标记基因的序列，各包含重组后编码有功能标记的部分序列（并且其中所述部分自身不编码有功能的标记）。[0019]本发明还涉及通过在体内实施的根据本发明所述的方法所产生的细胞。[0020]与现有方法相比，本发明方法的优势在于其允许在菌株转化中连续使用非反向选择标记（non-counterselectablemarker)。这是有利的，特别是在丝状真菌中，其中已知的反向选择标记数量有限且再循环标记用于重复使用极其重要。此外，[0021]这种系统允许使用单一多核苷酸中不包含完全敲除盒的载体。这避免了克隆问题，以及更稳定的核苷酸片段（在酵母或E.coli中位点特异性重组酶不能作用于其重组位点，例如因为它们并不都存在）。[0022]而且，使用可以通过利用自动方法扩增产生的核酸片段实施本发明的方法。这导致了更高通量的更为灵活的系统，因为片段扩增（例如通过PCR)比限制性消化更容易自动化。[0023]利用本发明的方法可以得到极其高效的菌株构建（接近100%效率），且所述方法可被用于比使用现有技术更快地产生多重敲除，因为可以在一个步骤中引入和/或除去多个标记。[0024]使用本发明的方法可以更易于表征地追踪菌株构建和修饰，因为位点特异性重组位点可以保留在祀位点（targetlocus)或多个祀位点（targetloci)。[0025]附图简沭[0026]图1展示了质粒pDELNicB-3的示意图，其是用于使A.niger中的nicB基因失活的置换盒的基础。置换盒包含nicB的侧翼区域、hygB标记盒、突变IoxP位点和E.coliDNA。在实施例部分（参见下文）可以找到关于pDELNicB-3的更多细节。[0027]图2展示了质粒pDEL_PdxA_2的示意图，其是用于使A.niger中的pdxA基因失活的置换盒的基础。置换盒包含PdxA的侧翼区域、ble标记盒、突变IoxP位点和E.coliDNA。在实施例部分（参见下文）可以找到关于pDEL_PdxA-2的更多细节。[0028]图3展示了质粒pDEL_EP0_Hyg_l的示意图，其包含使A.niger中的epo基因失活的置换盒的一部分。置换盒包含epo的侧翼区域、hygB标记盒的一部分、突变IoxP位点和E.coliDNA。在实施例部分（参见下文）可以找到关于pDEL_EPO_Hyg-l的更多细节。[0029]图4展示了质粒pDEL_EP0_CRE-l的示意图，其包含使A.niger.中的印〇基因失活的置换盒的一部分。置换盒包含epo的侧翼区域、hygB标记盒的一部分、突变IoxP位点、ere重组酶表达盒和E.coliDNA。在实施例部分（参见下文）可以找到关于pDEL_EP0_CRE-I的更多细节。[0030]图5展示了片段产生以及A.niger中的转化和重组中这些片段的使用的示意图。顶部展示了利用PCR扩增产生"二重左"（"bipartiteleft"）和"二重右"（"bipartiteright"）片段。底部图中展示了通过二重左片段和二重右片段在基因组内的同源重组转化A.niger。[0031]图6展示了片段产生以及A.niger中的转化和重组中这些片段的使用的示意图(同样展示于图5)。这个特定实施例中的各二重（bipartit)片段不同，因为它们另外包含Cre重组酶盒。最后的图展示了Cre诱导的重组事件之后产生的基因组位点的布局。[0032]图7展示了Cre诱导的侧翼为IoxP的hygB选择标记的丢失。上部板是Cre未诱导的转化体。下部板是通过涂布在作为碳源的木糖上而使Cre被诱导。百分比展示了Cre诱导后，A.niger菌落中标记移除的百分比。[0033]图8描述了用于在真菌中瞬时表达ere重组酶的pEBA513的图谱。pEBA513是PAMPF21衍生的载体，其包含AMl区域和CAT氯霉素抗性基因。显示的是ere重组酶基因(ere)表达盒，其包含A.nigerglaA启动子（Pgla)、cre重组酶编码区和niaD终止子。此夕卜，还展示了由A·nidulansgpdA启动子（PgpdA)、hygB编码区和P·chrysogenumpenDE终止子组成的潮霉素抗性盒。[0034]图9展示了利用PCR检测R.emersonii基因组中的pGBT0PEBA-205表达质粒。分离并利用PCR分析来自转化体A-A4(泳道2-4)和空菌株（泳道5-7)的基因组DNA。质粒DNA被用作PCR反应的对照模板：pGBTOPEBA-4(泳道8)、pGBT0PEBA-8(泳道9)和pGBTOPEBA-205(泳道10)。在PCR反应中，加入针对pGBTOPEBA-4(泳道2、5和8,预计片段：256bp)、pGBT0PEBA-8(泳道3、6和9,预计片段：306bp)和pGBT0PEBA-205(泳道4、7和10,预计片段：452bp)的引物。泳道1和11含有分子量标记。[0035]图10展示了无标记的R.emersonii转化体的表型分析和PCR分析。用milliQ水(对照）或PEBA513构建体转化转化体A-A4以使ere重组酶瞬时表达，其中转化体A-A4含有多拷贝的R.emersoniiCbhI和含有侧翼为IoxP的ble表达盒的pDEL_Pdx-A2质粒。[0036](图10A):生长于含lOyg/ml腐草霉素的PDA培养基（左侧图）和无选择的PDA(右侧图）的转化体和空菌株的MTP板的图片。行A展示了A-A4的两种milliQ对照转化体，其中A-A4包含具有侧翼为IoxP的ble表达盒（lox-ble-lox)的pDEL_Pdx-A2。行B展示了pEBA513转化的两种A-A4转化体（lox-ble_lox+pEBA513)的生长。亲本转化体A-A4(lox-ble-lox，转化前）生长于行C。最后，行D展示了空菌株的生长。[0037](图10B):利用ere重组酶移除标记之前和之后的转化体以及ere重组酶构建体的PCR分析。泳道2和泳道3展示了通过两种milliQ对照A-A4转化体的PCR分析得到的PCR片段，其中使用针对ble表达构建体中的pdx侧翼的引物。如果转化体仍然含有ble选择标记，那么2752bp的PCR条带是预计被扩增的PCR片段。泳道5和6展示了用pEBA513转化的两种A-A4转化体的PCR分析，其中使用针对pEBA513cre重组酶表达质粒的hygB基因的引物（314bp片段）。泳道8和9展示了用pEBA513转化的两种A-A4转化体的PCR片段，其中使用针对ble表达构建体的pdx侧翼的引物。881bp的PCR片段指示来源于R.emersonii转化体的ble表达盒的缺失。泳道1、4和7含有分子量标记。[0038]图11描述了ρΕΒΑΙΟΟΙ载体。部分载体片段和pEBA1002载体联合用于二重基因革巴向方法以使Rasamsoniaemersonii中的ReKu80ORF缺失。所述载体包含2500bp5'上游侧翼区、l〇x66位点、由A.nidulansgpdA启动子驱动的ble编码序列的5'部分和pUC19骨架（Invitrogen，Breda,荷兰）。转化R.emersonii菌株之前，用限制性酶Notl消化除去E.coliDNA。[0039]图12描述了pEBA1002载体。部分载体片段和ρΕΒΑΙΟΟΙ载体联合用于二重基因靶向方法以使Rasamsoniaemersonii中的ReKu800RF缺失。所述载体包含ble编码区的3'部分、A.nidulanstrpC终止子、1οχ71位点、ReKu800RF的2500bp3'下游侧翼区和pUC19骨架（Invitrogen，Breda,荷兰）。转化R.emersonii菌株之前，用限制性酶Notl消化除去E.coliDNA。[0040]图13描述了用于使R.emersonii的ReKu80基因缺失的策略。用于缺失ReKu80的载体包含侧翼为IoxP位点的重叠无功能ble选择标记片段（分开的标记）和用于靶向的ReKu80基因的5'和3'同源区（1)。构建体通过在基因组ReKu80位点和在重叠的同源无功能ble选择标记片段处的三同源重组（X)进行整合（2)，并且置换基因组ReKuSO基因拷贝（3)。随后，通过ere重组酶的瞬时表达导致1οχ66和1οχ71位点之间的重组移除选择标记，从而使ble基因缺失且剩余双突变的1οχ72位点留在基因组中（4)。使用这种总体策略，ReKu800RF被移除出基因组。[0041]图14展示了ReKu80敲除菌株的Southern印迹分析。从菌株中分离基因组DNA,然后用限制性酶HindIII消化。使用针对ReKu80基因的3'区的探针进行Southern印迹杂交。泳道1:野生型菌株；泳道2和3:两种腐草霉素抗性菌株显示出正确的ReKuSO敲除整合的片段大小；泳道4:被标记的分子量标记；泳道5和6:带有正确的ReKu80敲除整合的片段大小的两种腐草霉素敏感菌株。[0042]图15描述了pEBA1005载体，它和pEBA1006载体被联合用于二重基因靶向方法(bipartitegene-targetingmethod)以缺失Rasamsoniaemersonii中的RePepAORF0所述载体包含2500bp5'侧翼区、1οχ66位点、由A.nidulansgpdA启动子驱动的ble编码区的5'部分和pUC19骨架（Invitrogen，Breda,荷兰）。[0043]图16描述了pEBA1006载体，它和pEBA1005载体被联合用于二重基因靶向方法以缺失Rasamsoniaemersonii中的RePepA0RF。所述载体包含ble编码区的3'部分、A.nidulanstrpC终止子、1οχ71位点、ReKu800RF的2500bp3'侧翼区和pUC19骨架(Invitrogen,Breda,荷兰）。[0044]图17描述了用于缺失Rasamsoniaemersonii中的RePepAORF的pEBA10056载体。所述载体包含2500bp5'侧翼区，1οχ66位点，由A.nidulansgpdA启动子、ble编码区和A.nidulanstrpC终止子组成的ble表达盒，1οχ71位点，ReKu800RF的2500bp3'侧翼区和pUC19骨架（Invitrogen，Breda，荷兰）。[0045]图18展示了补充有1%酪蛋白钠盐的PDA平板图，其具有用包含2.5kb侧翼的ReP印A缺失构建体转化的ΛReKu80-2菌株和TEC-142S。[0046]图19展示了质粒pPepAHyg的示意图，其包含使R.emersonii中的RePepA基因失活的置换盒的一部分。置换盒包含1500个核苷酸的ReP印A5'侧翼区、hygB标记盒的一部分、突变的IoxP位点和E.coliDNA。在实施例部分（参见下文）可以找到关于pPepAHyg的更多细节。[0047]图20展示了质粒pPepACre的示意图，其包含使R.emersonii中的RePepA基因失活的置换盒的一部分。置换盒包含ReP印A3'侧翼区、hygB标记盒的一部分、突变的IoxP位点、ere重组酶表达盒和E.coliDNA。在实施例部分（参见下文）可以找到关于pPepACre的更多细节。[0048]图21展示了用于R.emersonii中的转化和重组的片段的示意图。用于缺失ReP印A的载体包含侧翼为IoxP位点的重叠无功能hygB选择标记片段（分开的标记）和用于靶向的ReP印A基因的5'和3'同源区（1)。构建体通过在基因组ReP印A位点和在重叠的同源无功能hygB选择标记片段处的三同源重组（X)进行整合（2)，并且置换基因组ReP印A基因拷贝（3)。随后，通过在木糖上培养转化体以诱导ere重组酶的表达导致1οχ66和1οχ71位点之间的重组移除选择标记，从而缺失hygB和Cre表达盒且剩余的双突变的1οχ72位点留在基因组中（4)。[0049]图22展不了Rasamsoniaemersonii中Cre诱导的侧翼为IoxP的hygB选择标记的丢失。带有侧翼为IoxP的hygB选择标记和ere重组酶表达盒被整合至PePepA位点的转化体被涂布在碳源为木糖的平板上以诱导ere重组酶。ere被诱导之后，将菌落转移至无选择的PDA(左）和潮霉素B选择的PDA(右）。空菌株作为选择对照被包括在内。[0050]图23展示了在S.cerevisiae中敲除ADEl基因的过程示意图，其中使用侧翼均在1οχ71和1οχ66之间的二重标记和具有诱导型启动子的ere重组酶。[0051]序列表描沭[0052]SEQIDNO:1展示了突变的IoxP位点，1οχ66。[0053]SEQIDNO:2展示了突变的IoxP位点，1οχ71。[0054]SEQIDN0:3展示了双突变的1οχ72位点。[0055]SEQIDN0:4展示了第一无功能的hygB标记片段（缺失hygB的3'末端编码序列的最后27个碱基的PgpdA-HygB序列）。[0056]SEQIDNO:5展示了第二无功能的hygB片段（缺失hygB的5'末端编码序列的开始44个碱基的HygB-TtrpC序列）。[0057]SEQIDNO:6展示了含有A.nidulans木聚糖酶A启动子、ere重组酶和木聚糖酶A终止子的ere重组酶盒，以允许ere重组酶的木糖可诱导表达。[0058]SEQIDNO:7展示了Ble-正向PCR引物的DNA序列；[0059]SEQIDN0:8展示了Ble-反向PCR引物的DNA序列；[0060]SEQIDNO:9展示了EBA205-正向PCR引物的DNA序列；[0061]SEQIDNO:10展示了EBA205-反向PCR引物的DNA序列；[0062]SEQIDNO:11展示了pGBT0PEBA4-正向PCR引物的DNA序列；[0063]SEQIDNO:12展示了pGBT0PEBA4-反向PCR引物的DNA序列；[0064]SEQ当前第1页1 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