一种食线虫真菌实验室批量化培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种动物寄生线虫病生物防治用菌种实验室批量化培养方法，具体涉及一种食线虫真菌实验室批量化培养方法。
【背景技术】
[0002]动物寄生线虫病是家畜感染的一类严重的寄生虫病，给畜牧业造成严重的危害，药物驱虫是其主要的控制措施。随着化学驱虫药所产生虫体抗药性问题、药物在动物性食品中残留对人体健康的威胁以及药物降解产物对生态环境的不良影响等的弊端被广泛认识。利用食线虫性真菌控制寄生性线虫感染来防治动物线虫病的新的生物技术倍受关注，食线虫性真菌是针对线虫的幼虫发挥作用，在其感染动物之前就将其杀死，避免了家畜的感染或重复感染，减轻了寄生虫对动物的危害程度，对于保护环境、维护生态平衡、发展无污染的绿色畜产品，具有极为重要的意义。目前，食线虫真菌的生产量少，不能满足批量化培养。迫切需要探索一种食线虫真菌实验室批量化培养的生产工艺。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是，提供一种食线虫真菌实验室批量化培养方法。
[0004]本发明解决其技术问题采用的技术方案是:一种食线虫真菌实验室批量化培养方法，包括以下步骤:
(1)将保存于2?6°C的试管斜面中的食线虫真菌菌种，转接于I%麸皮平板培养基，25?28°C避光培养4?7天，菌丝长满平皿的三分之二至长满培养皿的培养物作为一级种子;
(2)用无菌手术刀将步骤(I)中含有一级种子的培养物切去4mmX4mm的方块2?3个，转接于含2%麸皮液体培养基的三角烧瓶中，根据菌种生长速度不同，在转速80?160r/min振摇培养120?144小时，将振摇培养后的液体培养物作为二级种子；
(3)将玉米粒、小麦粒复合培养基分装于长37?45cm、宽11?15cm、一面装有直径为5?8cm除菌滤膜的聚乙烯塑料袋中，121 °C高压灭菌30?35分钟，冷却后将步骤⑵中所述的二级种子按5%?10%种子接种量接种于含有300?600g的玉米粒、小麦粒的所述聚乙烯塑料袋中，封口后轻按压袋子，使其混合均匀，然后置于25?28°C培养15?30天终止培养，即可收获分生孢子和厚垣孢子，以供动物寄生线虫病生防制剂的配制。
[0005]进一步，步骤(I)中，所述I %麸皮平板培养基由1g新鲜麸皮，蒸饱水100ml制成麸皮浸出液，琼脂粉浓度为2 %，制成。
[0006]进一步，步骤(2)中，所述2%麸皮液体培养基由20g新鲜麸皮，蒸馏水100ml制成麸皮浸出液，红糖浓度为2%，制成；所述振摇培养先在转速80r/min振摇48?72小时，然后在转速160r/min振摇72小时。
[0007]进一步，步骤(3)中，所述玉米粒、小麦粒复合培养基由玉米粒与小麦粒之比为1.5: I?2: 1，玉米粒和小麦粒与水比为1.3?1.6: I制成。
[0008]本发明食线虫真菌实验室批量化培养方法在实验室条件下可批量化生产，为今后工厂化生产动物寄生虫病生物制剂奠定了坚实的基础，实验证明，本发明分生孢子或厚垣孢子的产量可达1.20X 104?1.75X 10 6个/克。
【具体实施方式】
[0009]下面结合实施例对本发明进一步加以说明。
[0010]实施例1
(1)将保存于4°C的试管斜面中的食线虫真菌-鞭式达丁屯氏菌Duddingtoniaflagrans(与鞭式节丛孢Arthorbotiys flagrans同物异名)菌种，转接于I %麸皮平板培养基，26°C避光培养6天，菌丝长满平皿的培养物作为一级种子。其中，I %麸皮平板培养基的制备方法是:称取1g新鲜麸皮加入蒸馏水1000ml，微火煮沸I小时，纱布过滤，沉淀后，取上清液按每10ml加琼脂粉2g混合后，然后分装于三角烧瓶中，121 °C高压灭菌20分钟，即成。
(2)用无菌手术刀将含有一级种子的培养物切去4mmX4mm的方块2个，转接于含2%麸皮液体培养基的三角烧瓶中，置26°C培养，先80r/min振摇60小时，然后160r/min振摇培养72小时后的液体培养物作为二级种子。其中，2%麸皮液体培养基的制备方法是:将20g麸皮加入蒸馏水100ml按步骤(I)的方法制成浸出液，上清液按每10ml加2g红糖混合后，然后分装于三角烧瓶中，121°C高压灭菌20分钟，即成。
(2)将玉米粒、小麦粒复合培养基分装于长37cm、宽Ilcm的聚乙稀塑料袋中，该塑料袋一面装有直径5cm的除菌滤膜以便于通气，121°C高压灭菌30分钟，冷却后将二级种子按5%种子接种量接种于含有410g的玉米粒、小麦粒的上述塑料袋中，封口后轻按压袋子，使其混合均匀，然后置于26°C培养，根据菌种的生长特性不同，培养18天终止培养，收获少量的分生孢子和大量的厚垣孢子，其厚垣孢子产量为1.75 X 16个/克，以供动物寄生线虫病生防制剂的配制。其中，玉米粒、小麦粒复合培养基的制备方法是:称取玉米260g、小麦150g，两者相互混合，加入自来水260ml，然后分装于长37cm、宽Ilcm的聚乙稀塑料袋中，该塑料袋一面装有直径5cm的除菌滤膜以便于通气，121°C高压灭菌30分钟，即成。
[0011]实施例2
(1)将保存于4°C的试管斜面中的少孢节丛孢(Arthorbotiysoligospora)菌种，转接于I %麸皮平板培养基，25°C避光培养4天，菌丝长满平皿的三分之二后的培养物作为一级种子。
(2)用无菌手术刀将含有一级种子的培养物切去4_X4_的方块3个，转接于含2%麸皮液体培养基的三角烧瓶中，置25°C培养，先80r/min振摇48小时，然后160r/min振摇培养72小时，将此液体培养物作为二级种子。
(3)将玉米粒、小麦粒复合培养基分装于长37cm、宽Ilcm的聚乙稀塑料袋中，该塑料袋一面装有直径5cm的除菌滤膜以便于通气，121 °C高压灭菌30分钟，冷却后将二级种子按10%种子接种量接种于含有480g的玉米粒、小麦粒的上述塑料袋中，封口后轻按压袋子，使其混合均匀，然后置于26°C培养，根据菌种的生长特性不同，培养30天终止培养，收获分生孢子和少量的厚垣孢子，孢子产量为2.1 X 15个/克，以供动物寄生线虫病生防制剂的配制。其中，玉米粒、小麦粒复合培养基的制备方法是:称取玉米360g、小麦120g，两者相互混合，加入自来水300ml，然后分装于长37cm、宽Ilcm的聚乙稀塑料袋中，该塑料袋一面装有直径5cm的除菌滤膜以便于通气，121°C高压灭菌30分钟，即成。
[0012]实施例3
(1)将保存于4°C的试管斜面中的厚垣普奇尼亚菌(Pochoniachlamydosporia)菌种，转接于I %麸皮平板培养基，28°C避光培养7天，菌丝长到平皿的三分之二的培养物作为一级种子。
(2)用无菌手术刀将含有一级种子的培养物切去4_X4_的方块3个，转接于含2%麸皮液体培养基的三角烧瓶中，置28°C培养，先80r/min振摇72小时，然后160r/min振摇培养72小时后的液体培养物作为二级种子。
(3)将玉米粒、小麦粒复合培养基然后分装于长37cm、宽Ilcm的聚乙稀塑料袋中，该塑料袋一面装有直径5cm的除菌滤膜以便于通气，121°C高压灭菌30分钟，冷却后将二级种子按10%种子接种量接种于含有300g的玉米粒、小麦粒的上述塑料袋中，封口后轻按压袋子，使其混合均匀，然后置于28°C培养，根据菌种的生