生产漆酶的菌株、利用菌株生产漆酶的方法和生产的漆酶及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物酶学领域，特别涉及一种生产漆酶的菌株、以及利用该菌株生 产漆酶的方法和生产的漆酶。
【背景技术】
[0002] 近年来，染料由于价格低廉、对光照、温度和去污剂等稳定性强且颜色多样，已被 广泛应用于纺织品与着色剂制造工业等。随着纺织工业的迅速发展，染料的品种和数量不 断增加，印染行业已经成为我国自然水体最大的水资源消耗者和污染源之一。我国染料废 水每年排放6. 5X108吨左右，大量废水的排放又造成其他自然水体和土地的污染。数据显 示，每排放1吨印染废水就会造成20吨自然水体的污染。此外，染料废水具有组成复杂、有 机物含量高、水量和水质变化大、碱度高、色度深、可生化性差、难降解和浓度高等特点，而 且其中的硝基、氨基化合物及铜、铬、锌、砷等重金属元素均具有较大的生物毒性，是难以处 理的工业废水之一，会对环境造成极大的污染，破坏生态平衡，威胁人类健康。因此，寻找一 种高效、低廉、不产生二次污染的处理方法对于减轻染料废水的危害十分必要。
[0003] 近年来，随着人们环保意识的增强，白腐真菌胞外酶在污水治理方面的作用显得 极为重要，成为酶工程与环境保护交叉领域研宄的热点。大量研宄证明，白腐真菌胞外酶 不仅能够降解大量异生芳香化合物及其衍生物，还能去除复杂的木质素聚合物，因此这些 胞外酶的生物催化作用在环保领域具有巨大的潜在应用价值。其中，漆酶（Laccase，EC 1. 10. 3. 2)是一种含铜的多酚氧化酶，属于蓝色多铜蛋白家族，广泛分布于植物、真菌、昆虫 和细菌中。这类蛋白质具有四个富含组氨酸的铜原子结合区域，由于环境及光谱性质的不 同而分为I-III型。漆酶可通过电子转移催化氧化一系列底物，例如单、双及多酚、芳香胺、 甲氧基酚和抗坏血酸盐等化合物，这一氧化过程与氧分子还原成水分子相耦合。此外，漆酶 的作用底物广泛且具一定的底物特异性，能够被应用于染料脱色、纸浆造纸、食品加工、化 妆品制作、生物修复、生物检测、生物燃料和有机物合成等多个工业领域。目前为止，已从微 生物中分离得到了 1〇〇多种漆酶，但多数漆酶的活力及其产量较低且对极端环境的耐受力 也较弱，这些均阻碍了他们被大规模商业化应用。因此，开发性质优良的酶蛋白，扩展其应 用范围，具有十分重要的工业价值。
[0004] 绒毛栓孔菌（Trametes pubescens)作为一种常见的白腐真菌，是重要的生物资 源，目前研宄已发现其产漆酶活力较高，且对染料也有较好的脱色效果。本发明中通过硫酸 铵分级沉淀、阴离子交换柱层析和琼脂糖凝胶柱层析分离得到纯化的漆酶蛋白（Tplac)，研 宄其最适反应pH和温度，探索底物特异性、常见抑制剂和金属离子等对Tplac活性和稳定 性的影响，并将其应用于染料脱色中，以期得到性质优良稳定的酶蛋白，为进一步将漆酶应 用于更多领域提供可靠的理论依据。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有利用微生物生产的漆酶、漆酶生产方法存在的技术问题 提供一株生产漆酶的菌株、以及利用该菌株生产漆酶的方法和生产的漆酶。本发明的真菌 菌株是从广东省车八岭自然保护区的栲树（Castanopsis fargesii Franch.)倒木上分离 筛选获得的，该真菌菌丝生物量高，获得的漆酶活力高、对碱性条件的活性、稳定性和耐受 性强；对金属离子的耐受力较高，能够缩短偶氮染料刚果红完全脱色所需的时间，具有潜在 的应用价值，可被应用于较多工业领域，具有良好的开发应用前景。
[0006] 为实现本发明的目的，本发明一方面提供一株生产漆酶的菌株绒毛栓孔菌 (Trametes pubescens BJFC-C1108)，其微生物保藏编号为 CGMCC No. 10308。
[0007] 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
[0008] 本发明生产漆酶的菌株为绒毛栓孔菌（Trametes pubescens BJFC-C1108)，其微 生物保藏编号为CGMCC No. 10308,分类命名是：Trametes pubescens ;保藏时间：2015年1 月7日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路，中国科学院微生物研宄所；保藏单位：中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC)。
[0009] 本发明的绒毛栓孔菌菌株固体及液体培养条件下的形态特征：
[0010] 固体培养条件下，菌株域毛检孔菌（Trametes pubescens BJFC-C1108)于28±3°C 恒温静置培养7-8天后即可铺满直径为90mm的平皿，长势较快，菌丝致密规则，呈白色绒 毛状。培养7天后显微镜下观察发现，生殖菌丝具锁状联合，无色，薄壁，时有分枝，直径 1-4 y m ;骨架菌丝嗜蓝，厚壁，多分枝，直径2-4 y m。
[0011] 液体培养条件下，初期菌丝球表面致密光滑，形态饱满，长势良好，后期其表面呈 星芒状，14天后开始出现自溶现象。
[0012] 本发明的绒毛栓孔菌发酵培养时分泌漆酶到培养基中。
[0013] 菌株绒毛栓孔菌是从广东省车八岭自然保护区的栲树倒木上采集后通过分离、纯 化培养基筛选获得的。
[0014] 本发明的绒毛栓孔菌（Trametes pubescens BJFC-Cl 108)的分离筛选方法：
[0015] 从广东省车八岭自然保护区的栲树倒木上采集的白腐真菌绒毛栓孔菌，用采集刀 将新鲜子实体从基物上小心剥离，去掉与子实体无关的杂质，在超净工作台中切取子实体 上靠近基部的菌肉（大小约为3. 5cmX3. 5cmX3. 5cm)接种到分离、纯化平板培养基上，于 28±3°C下恒温静置培养7-8天后，挑取培养基中新长出的菌丝作为接种块转接入新的分 离、纯化培养基上进行纯化培养，如此反复，直至平板培养基中的菌丝形态致密规则、呈白 色绒毛状即视为完成纯化过程。
[0016] 本发明菌株绒毛栓孔菌（Trametes pubescens BJFC-C1108)的分离、筛选、纯化及 生产漆酶的培养基如下：
[0017] 分离、纯化培养基：葡萄糖20. Og/L，麦芽浸粉20. Og/L，琼脂25. 0g/L，KH2P043. Og/ L，青霉素0. 2g/L，链霉素0. 2g/L，去离子水lOOOmL，pH自然。
[0018] 固体平板培养基（活化培养基）：葡萄糖20.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，琼脂粉 20. 0g/L，KH2PO4L 0g/L，MgSO4 ? 7H20 0? 5g/L，ZnSO4 ? 7H20 50mg/L，维生素 BI 10mg/L，去离 子水IOOOmL，pH自然。
[0019] 液体培养基（发酵培养基）：葡萄糖20. 0g/L，酵母浸粉5. 0g/L，KH2PO4L 0g/L， MgSO4 ? 7H20 0? 5g/L，ZnSO4 ? 7H20 50mg/L，维生素 B110mg/L，去离子水 1000mL，pH 自然。
[0020] 本发明的绒毛栓孔菌（Trametes pubescens BJFC-Cl 108)的培养特性：
[0021] 本发明的绒毛栓孔菌（Trametes pubescens BJFC-Cl 108)是一种白腐真菌，固体 培养条件下于28±3°C恒温静置培养7-8天后即可铺满直径为90mm的平皿，长势较快，菌 丝致密规则，呈白色绒毛状。培养7天后显微镜下观察发现，生殖菌丝具锁状联合，无色，薄 壁，时有分枝，直径1 _4 y m ;骨架菌丝嗜蓝，厚壁，多分枝，直径2-4 y m。液体培养条件下，初 期菌丝球表面致密光滑，形态饱满，长势良好，后期其表面呈星芒状，14天后开始出现自溶 现象。
[0022] 本发明另一方面提供所述绒毛栓孔菌（Trametes pubescens BJFC-Cl 108)在制备 漆酶中的应用。
[0023] 其中，所述的应用是将所述绒毛栓孔菌（Trametes pubescens BJFC-Cl 108)在有 氧及避光条件下发酵培养。
[0024] 特别是，所述发酵培养的温度为28±3°C ;培养过程中振荡速度为100_200rpm，优 选为150rpm ;培养时间为5-7天，优选为6天。
[0025] 其中，所述发酵培养的发酵培养基包括碳源、氮源和无机成分。
[0026] 特别是，所述发酵培养基的碳源选择麦芽糖、蔗糖或葡萄糖，优选为葡萄糖；所述 氮源选择酵母浸粉；所述无机成分选择KH 2P04、MgSO4 ? 7H20和ZnSO4 ? 7H20。
[0027] 特别是，所述发酵培养基还包括维生素BI。
[0028] 其中，所述IL发酵培养基由下列物质组成：葡萄糖20. 0g，酵母浸粉5. 0g， KH2PO4L 0g，MgSO4 ? 7H20 0? 5g，ZnSO4 ? 7H20 50mg，维生素 BI 10mg，其余为去离子水。
[0029] 特别是，所述发酵培养温度为28±3°C ;培养过程中振荡速度为100_200rpm，优选 为150rpm ;培养时间为5-7天，优选为6天。
[0030] 发酵培养完成后，可以采用常规分离方法从培养基中分离出漆酶，也可以按照如 下步骤分离纯化漆酶：过滤、离心分离、硫酸铵分级沉淀、阴离子交换柱层析、琼脂糖凝胶柱 层析。通过这些分离步骤可以去除发酵培养过程中产生的杂蛋白和其他杂质。
[0031] 发酵培养绒毛栓孔菌（Trametes pubescens BJFC-Cl 108)获得漆酶也属于本发明 的保护范围。
[0032] 本发明又一方面提供所述的绒毛栓孔菌（Trametes pube