自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备方法及其生物美容产品的制作方法
【专利说明】自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备方法及其生物美容产口叩
技术领域
[0001]本发明涉及自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备的方法以及通过所述方法获得的生物美容产品。特别地，本发明涉及通过从自体皮肤中获取表皮细胞和培养得到成纤维细胞，将其中一种或两种细胞添加到自体外周血富含血小板的血浆中，同时还可以添加营养因子，生产出含自体活细胞的生物美容产品，本发明的生物美容产品可用于白癜风祛斑、疤痕修复、皮肤祛皱以及除斑等美容作用。
【背景技术】
[0002]日前，市场上已经出现了各种细胞用于美容方面的产品，也被商家赋予了各种神奇的功效和希望，尤其是干细胞在美容方面的应用。事实上，活细胞在医学美容的应用上取得一些很好的效果，主要体现在皱纹填充、祛斑等方面起到一定作用。但是现在市场上应用的活细胞多数都为同源异体的，进入皮肤内容易发生免疫排斥而被清除，因而在皮肤中发挥作用的细胞微乎其微。
[0003]细胞生长因子也是一直受追捧的美容方法，出现很多细胞生长因子被应用到美容中，包括干细胞因子、表皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、神经生长因子及纤维母细胞生长因子等。各种细胞因子需要在低温条件下保存，以保持其蛋白活性。然而在化妆品制作过程中，由于无法保证整个生产过程均处在低温条件下，那么添加该产品极易造成细胞因子的失活和变性，从而失去细胞因子对组织和细胞的修复活性。同时，细胞因子加入到化妆品中，其有效浓度必然被降低，不能保证细胞因子对细胞核组织的修复效果。消费者在使用过程中很难对该产品进行定量使用，可能会造成效果不稳定的现象。
[0004]另外，羊胎素和肉毒杆菌内毒素作为目前备受消费者青睐的产品，因其使用简便、效果显著、安全可靠而广受欢迎。但它们使用后的副反应较多，常见的有表情不自然、畏光流泪、局部肿胀、淤斑、注射部位麻木、头痛、额部紧绷感、邻近部位皱纹加深等。这两种因子应用易产生较明显的依赖性，随着注射的次数增多，人对其的敏感性降低，而导致病人使用该方法更为频繁，每次的使用量也会逐渐增多。
[0005]综上，因为各种原因和问题，目前市场上生物美容产品存在各种效果不佳，对人们的皮肤美容的疗效还远远不够，即使其中加入各种营养成分。本发明利用个体化的材料和营养物质，发挥其细胞生物学活性和自分泌营养因子的功能，将对消费者的美容效果达到更佳的美容作用，并且联合美容物理疗法将产生更好的白癜风祛斑、疤痕修复、皮肤祛皱以及除斑等效果。
【发明内容】
[0006]本发明是我们研发团队通过多年的科研工作，发现了能从自体皮肤中获得表皮细胞和成纤维细胞，通过体外体内实验证实这两种细胞对皮肤产生更好地白癜风祛斑、疤痕修复、皮肤祛皱以及除斑等作用。本发明利用自体皮肤来源的表皮细胞和成纤维细胞的生物学作用，可以高效产生皮肤美容作用，而且联合美容物理疗法将产生更好功效。本发明中的表皮细胞是成对存在，中间的孔隙中气孔，可以进行气体交换，细胞内有叶绿体，对皮肤起重要保护作用。
[0007]本发明中成纤维细胞是皮肤真皮中的主体细胞成分，其分泌的胶原纤维，弹性纤维及基质成分，与成纤维细胞一同构成了真皮的主体。尽管很多化妆品公司和美容医生声称非介入的美容方法能达到使皮肤皱纹消失的效果，但科学研宄表示这一方法的效果是有限的。皮肤衰老反映在细胞水平即为细胞衰老。当紫外线和其他外界环境能刺激成纤维母细胞，上调胶原酶的基因表达，从而使胶原酶生成增多，这导致了胶原蛋白被降解，水分流失，皮肤组织失去支撑，皱纹和黄斑即生成。
[0008]本发明提供了自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备的方法，其中，所述方法包括通过从自体皮肤中获取表皮细胞和培养得到成纤维细胞。
[0009]本发明所述的自体表皮细胞由自体皮肤经酶消化法和机械法直接获得表皮单细胞悬液，减去了中间复杂的过程，并保证了表皮细胞的活性和数量。获得的表皮细胞经western blotting蛋白质表达检测，其高表达特异高表达表皮生长因子(Epidermalgrowth factor, EGF)。
[0010]同时，本发明所述的自体成纤维细胞由同一皮肤的真皮经酶消化法和机械法获得细胞悬液后，在体外培养条件下获得足量的成纤维细胞，并western blotting蛋白质表达检测特异高表达成纤维生长因子(Fibroblast growth factor，FGF)。
[0011]本发明所述的自体皮肤来源于耳后取皮、眼袋割除后皮肤、手臂取皮和腿上取皮等，优选地，选择耳后取皮。
[0012]本发明还提供了含自体表皮细胞和/或成纤维细胞的生物美容产品，其中，所述产品包括将其中一种或两种细胞添加到自体外周血富含血小板的血浆中，同时可以添加营养因子，生产出含自体活细胞的生物美容产品。
[0013]本发明所述的自体富含血小板血浆是通过采集抗凝外周血两次离心获得的富含血小板的血浆，其富含各种生长因子，其中成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子与血管内皮生长因子等。
[0014]含自体表皮细胞和/或成纤维细胞的生物美容产品主要由如下成分组成:
[0015]I) 1-20 X 16自体表皮细胞和/或成纤维细胞；
[0016]2) l_50ml自体富含血小板血浆；
[0017]3)任选的1ng-1ug营养因子；
[0018]生物美容制剂装入1ml无菌的塑料针管中，可用盖子密封包装，形成产品。
[0019]该生物美容制剂保存在4°C条件下，保质期为48小时。
[0020]本发明所述的一种或两种自体表皮细胞和/或成纤维细胞，优选地包括加入自体表皮细胞和成纤维细胞两种细胞。
[0021]本发明所述的营养因子，即为超氧化歧化酶、灵芝多糖、胎盘提取多肽素和银杏叶提取液等，优选地，含有两种以上。
[0022]通过本发明的方法，通过自体皮肤获取的表皮细胞和/或成纤维细胞，加入到自体外周血来源的富含血小板血浆，优选添加一种或多种皮肤营养因子，制备成生物美容产品。由本发明提供的方法得到含有自体皮肤获取的表皮细胞和/或成纤维细胞的生物美容产品，能够对白癜风祛斑、皮肤疤痕修复、皮肤祛皱以及除斑等功能。特别当联合物理美容疗法使用时，将产生更佳的美容疗效，即白癜风磨削术、高温深蓝射频美容疗法、微针疗法等，能打开表皮毛孔或微创表皮皮层，为营养因子和细胞进入皮肤的通道，有助于皮肤的再生增殖。
【附图说明】
[0023]图1表示由实施例2所制备的成纤维细胞在倒置显微镜下观察的生长图片。
[0024]图2表示由实施例3制备的自体成纤维细胞表达成纤维细胞生长因子WesternBlotting 图片。
[0025]图3表示I名女性经由实施例5所制备的自体表皮细胞和成纤维细胞的生物美容广品治疗后腿部白癒风改善的图片。
【具体实施方式】
[0026]本发明提供了自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备的方法，其中，所述方法包括通过从自体皮肤中获取表皮细胞和培养得到成纤维细胞。
[0027]所述自体表皮细胞由取人0.l-2cm2皮肤，用IX磷酸盐缓冲液(PBS，pH值7.4，含100活性单位/ml青霉素和0.lmg/ml链霉素)5ml浸润15分钟，用Iml移液枪吸弃，再用I XPBS (pH值7.4，含100活性单位/ml青霉素和0.lmg/ml链霉素)同样反复中洗，洗涤后用disperse II消化，放置4°C冰箱过夜，第二天取出皮肤用镊子将表皮和真皮撕开。
[0028]表皮用眼科剪刀剪碎至Imm3左右，用I XPBS洗涤后加入到15ml离心管中，1000转每分种离心5分钟后弃上清，加入3ml 0.25% (质量体积比)胰酶消化1_60分钟，其中胰酶含质量体积比0.01% EDTA ;消化后过40 μπι细胞筛，过滤后加入5-10ml 1XPBS，经1000转每分钟离心10分钟得到细胞沉淀，再次5-15ml IXPBS重悬后，经1000转每分钟离心10分钟获得表皮细胞沉淀，加l_5ml 0.9%生理盐水重悬，苔盘兰计数，得到的17-1O8表皮细胞放置4°C冰箱存放备用。获得的表皮细胞经western blotting蛋白质检测表皮细胞生长因子表达水平，经灰度分析结果显示其灰度值达到9000以上。
[0029]获得的表皮细胞经western blotting蛋白质检测，其高表达表皮细胞生长因子。本发明的制造方法中对表皮细胞进行冻存，冻存液优选为90%胎牛血清和10%二甲基亚砜。复苏后培养的表皮细胞仍高表达EGF。
[0030]所述自体成纤维细胞由上述获得真皮用眼科剪刀剪碎至Imm3左右，用IXPBS洗涤后加入到15ml离心管中，1000转每分种离心5分钟后弃上清，加入3ml 0.25%胰酶消化1-60分钟，消化后过40 μπι细胞筛，过滤后加入5-10mllXPBS，经1000转每分钟离心10分钟得到单