GhGL3基因启动子、载体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，更具体地，涉及一种GhGL3基因启动子、载体 及其应用。
【背景技术】
[0002] 我国是棉花产量和消费量最高的国家之一。棉花原产于亚热带，是锦葵科棉花属 植物的种子纤维。棉花纤维细胞是由棉花种皮的单细胞发育而来，经历起始、初生壁合成、 次生壁合成和成熟期四个时期。成熟的棉花纤维白色至白中带黄，长约2至4厘米，含纤维 素约87-90%。棉花分为粗绒棉、长绒棉和细绒棉三种。中国的细绒棉占棉花产量的98%， 栽培最为广泛的陆地棉属于细棉绒。因此，棉花种子的表皮毛纤维细胞，特别是陆地棉不仅 是研宄植物单细胞发育及纤维素沉积的良好研宄材料，而且有着极其重要的应用价值。 [0003] 分子遗传学证明不同植物的表皮毛发育具有高度保守性。拟南芥表皮毛是一种特 化的单细胞表皮结构，广泛分布于叶片、茎、莲座叶、花瓣和根上。棉纤维作为一种子房胚珠 外珠被上的单细胞表皮毛，它的发育启动机制类似于拟南芥表皮毛的形成机制。
[0004] 目前已经证明，拟南芥表皮毛和根毛的启动至少是由三个基因（GL1 (or WER) -GL3 (or EGL3) -TTG1)产物组成的复合体MYB-bHLH-WD40促进GL2和R3类MYB转录因 子（包括TRIPTYCHON、TRY和CPC)的表达来控制。GL2转录因子会促进下游基因表达来达 到促进表皮毛起始发育，抑制根毛的起始发育。但此模型也并不排除它们中的每个单基因 都对表皮毛的启动有促进作用。其中，GLl编码R2R3类MYB转录因子，结构和功能上相当 于WER。GhMYB109是棉花中第一个克隆到得R2R3类转录因子，在棉花纤维的起始和伸长期 表达，控制着棉花纤维的发育。TTGl介导蛋白质和蛋白质相互作用，为正向的调控因子。其 中AtGL3(匪148067)和AtEGL3(匪202351)编码拟南芥转录复合体中的bHLH类转录因子。 酵母双杂实验证明GL3/EGL3在转录复合体中起着桥连作用，与WER、TRY、CPC和TTG都有相 互作用。
[0005] GhGL3 (GhDEL65AF336280)的基因长度 2513bp，ORF 长度 1863bp，编码一个 620 个 氨基酸的蛋白（AAK19613. 1)，具有典型的bHLH类转录因子的特点。对拟南芥和棉花的bHLH 类转录因子基因进行同源性分析，GhGL3和AtEGL3基因的ORF同源性为52. 1%，氨基酸序 列同源性为79. 15% ;GhGL3和AtGL3的基因 ORF序列同源性为61%，氨基酸序列同源性为 49.38 %〇
[0006] 根据棉花基因组数据的分析，GL3在DD基因组雷蒙德氏棉Gossypium raimondii 第4号染色体的contigl241上，基因长度为2513bp，包含8个内含子；在AA基因组亚洲棉 的Gossypium arboreum第3号染色体的contigl205上，基因长度为2519bp，也包含8个内 含子。经过DNAMAN软件分析，GrGL3和GaGL3基因的序列一致性达到97. 61%。Southern blot结果也显示GL3在AADD基因组陆地棉Gossypium hirsutum中以双拷贝形式存在。
[0007] GhGL3和GaGL3的ORF序列同源性为98 %。两个基因都编码620个氨基酸，其中有 20个氨基酸的不同，氨基酸序列一致性达到96. 45 %。用AtGL3启动子驱动GaGL3 (GaDEL65 JN997400)的表达可以互补拟南芥突变体gl3-l的表皮毛发育表型；原位杂交实验和 qRT-PCR实验结果显示GaGL3主要在棉花的纤维中表达。酵母双杂交和免疫共沉淀实验 提示GaGL3与GaMYB23和GaTTGl形成转录复合体调控亚洲棉的纤维发育。RT-PCR以及 qRT-PCR分析发现GhGL3只在花期以前、花期和开花初期的胚珠中表达，而在花粉及叶子中 都不表达，组织原位杂交也同样发现该基因在纤维起始期和伸长期表达，由此推测GhGL3 是在胚珠中特异表达、与棉纤维发育功能相关的基因，其启动子可能对棉花纤维的起始及 伸长起重要的调控作用。
[0008] 启动子是基因的表达调控元件，决定基因的活动和产生哪一种蛋白质。目前已知 的棉花纤维特异表达的启动子GaRDLl启动子（陈晓亚2006)，fdh基因启动子（朱玉贤 2011)和fifl启动子（Chen et al 2009)等得到了克隆。但是对于控制表皮毛发育的转录 因子复合体MYB-bHLH-WD40,目前已知的第一个克隆的R2R3类转录因子GhMYB109的启动子 得到了克隆，并申请了专利，bHLH类基因的启动子还未见报道。
[0009] 克隆GhGL3基因的启动子不仅能丰富棉花纤维特异/优势启动子资源，而且有助 于研宄棉花纤维和表皮毛的发育，也能满足棉花纤维发育相关基因功能验证和纤维品质转 基因育种的需要。
【发明内容】
[0010] 有鉴于此，本发明的主要目的之一在于提供一种GhGL3基因启动子、载体及其应 用，以获得棉花、拟南芥等植物花蕾纤维和表皮毛的特异表达启动子，从而能够对棉花、拟 南芥等植物的培育进行优选和控制。
[0011] 为了实现上述目的，作为本发明的一个方面，本发明提供了一种GhGL3基因启动 子，其具有如SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列，或者是将如SEQ ID No. 1或 SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列相同的活性。
[0012] 其中，所述GhGL3基因启动子的核苷酸序列与所述SEQ ID No. 1所示的核苷酸序 列具有75%以上的同源性，或者与所述SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列具有80%以上的同 源性。
[0013] 其中，所述GhGL3基因启动子为在所述启动子的任一片段上具有扩增的引物对的 启动子，以及
[0014] 所述上游引物和下游引物之间的距离在所述GhGL3基因启动子的第1碱基到第 4320个碱基之间，优选在第2313碱基到第4320个碱基之间，所述引物对中的每一个引物的 长度为15到30个碱基。
[0015] 以及，含有如上任意一项所述的GhGL3基因启动子的载体。
[0016] 其中，所述载体为 pBIlOL 2-GhGL3 pro ::⑶S0
[0017] 其中，在所述GhGL3基因启动子转录起始后加入了别的基因的编码序列或增强 子。
[0018] 其中，在所述载体中加入了植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物。
[0019] 其中，所述载体通过使用基因枪、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、 微注射或电导技术方法导入植物细胞。
[0020] 以及，含有如上任意一项所述的载体的宿主细胞。
[0021] 以及，含有如上任意一项所述的GhGL3基因启动子的转化植物细胞。
[0022] 其中，所述被转化的植物是单子叶植物或双子叶植物。
[0023] 其中，所述被转化的植物是棉花或拟南芥。
[0024] 作为本发明的另一个方面，如上任意一项所述的GhGL3基因启动子在培育纤维植 物新品种中的应用。
[0025] 其中，所述植物为棉花或者拟南芥。
[0026] 以及，如上任意一项所述的GhGL3基因启动子在植物组织中表达模式的应用。
[0027] 其中，所述植物组织为花蕾纤维和表皮毛。
[0028] 以及，如上任意一项所述的GhGL3基因启动子在棉花纤维和表皮毛的特异表达上 的应用。
[0029] 基于上述技术方案可知，本发明的GhGL3基因启动子具有以下有效效果：（1)本 发明的启动子可以引导外源基因在棉花等植物中表达，将获得使某目的基因在棉花纤维中 表达的转基因细胞系及转基因植株；(2)在构建到植物表达载体中时，在其转录起始后可 加上任何一种基因的编码序列或任何一种增强子；(3)为了便于对转基因植物细胞或植物 进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗 生素标记物；(4)携带有本发明启动子的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒 载体、直接DNA转化、微注射、电导等常规生物技术方法导入植物细胞，被转化的植物宿主 既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物；(5)当本发明的启动子被用于目的基因在棉 纤维中特异表达或改变棉花纤维数量、质量性状时，可采用以下方法：①将本发明的启动子 克隆到植物转化载体中，在其后接上目的基因的编码序列；②将所构建的植物转化载体转 化可再生棉花组织（或器官）并使本发明启动子在转化的组织中表达；③将被转化的组织 (或器官）培养成需要的棉花植株，从而本发明的GhGL3基因启动子可以驱动目的基因在棉 纤维和表皮毛中特异表达，并对培育纤维植物新品种，特别是培育棉花新品种具有重要意 义。
【附图说明】
[0030] 图1是本发明的GhGL3启动子与⑶S基因的融合表达载体图谱和转基因植株鉴 定；
[0031] 图2是本发明的GhGL3启动子：:⑶S基因在棉纤维起始期至伸长期（-1DPA-5DPA) 的表型照片；
[0032] 图3是本发明的GhGL3启动子：：⑶S基因在棉花叶片上的表型照片；
[0033] 图4是本发明的GhGL3启动子：：GUS基因在棉花植株花器官上的表型照片；
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