一种检测所有11种衣原体的定量pcr的引物、探针及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一种基于衣原体23S rRNA基因序列，适用于 所有11种衣原体的实时FRET-PCR方法检测的定量PCR的引物、探针及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 衣原体为革兰阴性，介于细菌和病毒之间的病原，属于严格细胞内寄生，在自然界 中广泛存在。衣原体能够感染哺乳动物、禽类和人，可引起多种动物和人类的疾病，并且不 同种属衣原体还可以在不同宿主之间传播，这对养殖业健康发展、动物产品进出口贸易和 人类健康等公共卫生安全领域均造成巨大经济损失。其中沙眼衣原体、肺炎衣原体、流产衣 原体及鹦鹉热衣原体为重要人畜共患病病原：沙眼衣原体主要引起人的泌尿生殖道感染、 沙眼、结膜炎、婴儿肺炎和淋巴肉芽肿等疾病；肺炎衣原体常引起人的上呼吸道感染，通过 呼吸道分泌物在人际间传播，慢性感染也与脑梗死、急性心肌梗死、原发性高血压和哮喘病 有一定关系；流产衣原体是全球性引起绵羊、山羊流产和经济损失的重要病原，也可感染人 引起流产；鹦鹉热衣原体感染鹦鹉科和其它种类的鸟类，主要存在于感染鸟粪便、鼻腔分泌 物和羽毛，还能通过吸入污染病原体的尘埃传播给人类。对动物致病的衣原体主要包括猪 衣原体和家畜衣原体：猪衣原体感染引发鼻炎、结膜炎、肺炎、肠炎、无症状感染、母猪流产 等；家畜衣原体感染引起肺炎、多发性关节炎、胸膜炎、心包炎和流产。
[0003] 衣原体根据16S和23S rRNA基因序列的不同分为11个种：肺炎衣原体 (C. pneumoniae)、沙眼衣原体（C. trachomatis)、鹤踏热衣原体（C. psittaci)、流产衣原体 (C. abortus)、家畜衣原体（C. pecorum)、鼠衣原体（C. muridarum)、猪衣原体（C. suis)、猫 衣原体（C.felis)、豚鼠衣原体（C.caviae)，及新发现的C.avium和C.gallinacea。
[0004] 衣原体常用的检测方法包括分离培养、吉姆萨染色或荧光抗体染色、间接血凝试 验（IHA)、补体结合试验（CF)、酶联免疫吸附试验（ELISA)、环介导等温扩增法（LAMP)、多聚 酶链式反应（PCR)等技术。传统方法主要依赖于分离培养，常用的有细胞培养法、鸡胚分离 法和小鼠接种等，但这种方法耗时长、灵敏度有限、检测衣原体种类有限而导致漏检；ELISA 方法结果准确，快速易行，适合批量样品检测，但会与其它微生物之间产生交叉反应，不能 区分多种衣原体；IHA和CF的特点是方便，对设备要求低，但特异性和灵敏度较低，无法区 别免疫接种和自然感染，康复动物抗体也可能存在易造成假阳性；目前报道的单一 PCR方 法不能同时检测多种衣原体；现存的多重PCR法可以对一种以上的序列同时进行扩增，达 到检测衣原体不同种属的目的，但缺乏标准化试剂。目前检测衣原体技术发展很快，方法日 渐增多，利用新型分子生物学方法是检测病原新的发展趋势。因此，亟需建立一种针对所有 11种衣原体的精准而又快速高效的广谱检测、监控和鉴别技术。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种检测所有11种衣原体的定量PCR的引物、探针及试剂 盒，以建立一种针对所有11种衣原体的精准而又快速高效的广谱检测、监控和鉴别技术。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] 1)基因选择：
[0008] 目前对衣原体基因组的研究主要集中于16S rRNA基因，23S rRNA，OmpA基因等。 本系统选择所有11种衣原体的23S rRNA基因作为目的基因，对其序列进行比对分析，筛选 出序列相似的区域，利用在线引物设计软件设计特异性的引物和探针各三条，两条上游引 物和一条下游引物扩增区域具有一定的多态性，能鉴别不同种属的衣原体。
[0009] 2)获得23S rRNA基因的序列：
[0010] 从 GenBank(www. ncbi. nlm. nih. gov)获取如下代表株的 23S rRNA 基因序列： 肺炎衣原体（C. pneumoniae) :NR076161 ;沙眼衣原体（C. trachomatis) :NR103960 ;婴鸟 鹉热衣原体（C.psittaci) :NR102574;流产衣原体（C.abortus) :NR077001;家畜衣原 体（C. pecorum) :NR103180 ;鼠衣原体（C. muridarum) :NR076163 ;猪衣原体（C. suis): U68420;猫衣原体（C.felis) :NR076260;豚鼠衣原体（C.caviae) :NR076195;C.avium: NR121988 ;C. gallinacea :AWUS01000004(270483-273417bp)。 用 Clustal Multiple Alignment Algorithm的方法对所有序列进行比对分析，寻找衣原体23S rRNA基因的相对 保守序列。据此，设计的引物和探针如下：
[0011] 一种检测所有11种衣原体的定量PCR的引物、探针，所述引物和探针如下：
[0012] 上游引物 1 :5' -GGGGTTGTAGGGTCGATAAYATGRGATC-3'（SEQ ID NO. 1)
[0013] 上游引物 2 :5'-GGGGTTGTAGGRTTGRGGAWAAAGGATC-3'（SEQ ID NO. 2)
[0014] 下游引物：5' -TGGAGAGTGGTCTCCCCAGATTCANACTA-3'（SEQ ID NO. 3)
[0015] 探针 1 :5'-(Cy5. 5660)-YDCCTGAGTAGRNCTAGACACGTGAAAC-磷酸-3'（SEQ ID NO. 4)
[0016] 探针 2 :5,-ACGAAAAAACAAAAGACTCTATTCGAT-(6-FAM)-3'（SEQ ID NO. 5)
[0017] 探针 3 :5'-ACGAAAGGAGAKMAAGACYGACCTCAAC-(6-FAM)-3'（SEQ ID NO. 6)。
[0018] 3) FRET-PCR 技术：
[0019] 此法使用针对衣原体23S rRNA基因序列特异性的引物和探针进行PCR检测。荧 光共振能量转移（FRET)技术明显优于SYBR Green I荧光染料法。SYBR Green I荧光染 料法不能区分特异的PCR产物和引物二聚体等非特异产物，特异性劣于本发明使用的FRET 技术。
[0020] 本发明还提供了一种检测所有11种衣原体的定量PCR的试剂盒，所述试剂盒包含 的引物序列如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 3所示，探针序列如SEQ ID NO. 4-SEQ ID NO. 6所 /Jn 〇
[0021] 所述试剂盒每20 μ 1包括：DNA模板10. 00 μ 1、100 μ M上游引物0. 20 μ 1、 100μΜ 下游引物 0· 20μ 1、100μΜ 探针-10. 04μ 1、100μΜ 探针-20. 02μ 1、100μΜ 探 针-30.02yl、5XPCR 缓冲液 4·00μ1、10μΜ dNTP 0·40μ1、5υ/μ1 Taq 酶 0.30yl、PCR 级超纯水4. 82 μ I。
[0022] 23S rRNA基因-PCR特异性的确定
[0023] 本发明的特异性从三个方面得到保证：
[0024] (1)设计的引物和探针经过NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)的BLAST搜索， 确认本发明设计的引物能特异地扩增11种衣原体的核酸，而不扩增其它非衣原体尤其是 与其相近种属病原体的核酸。通过BLAST确认，RT-PCR探针和引物能特异地扩增和检测所 有11种衣原体的核酸，但不扩增其他病原体核酸；
[0025] (2)本发明可以检测所有11种衣原体（肺炎衣原体；沙眼衣原体；鹤鹉热衣 原体；流产衣原体，家畜衣原体，鼠衣原体，猪衣原体，猫衣原体，豚鼠衣原体，C. avium， C. gallinacea)。结果表明，本发明系统可以特异、高效、稳定地扩增所有11种衣原体的核 酸；
[0026] (3)观察以上扩增对象在PCR过程中荧光强度（660nm)的变化。荧光在660nm波 长出现或增强，显示阳性；根据扩增对象FRET-PCR熔解曲线T m值的差异，可分为8个类别 共11种衣原体（图18)。Tm值相近或重合的衣原体种属可进行PCR产物测序，将测序结果 与GenBank公布的衣原体23S rRNA基因序列进行比对分析，证实这种衣原体23S rRNA基 因-PCR方法的特异性较高。
[0027] 23S rRNA基因-PCR灵敏度的确定
[0028] 根据所有11种衣原体23S rRNA基因标准序列的分子量和绝对重量以及 Pic0Green的DNA定量技术，计算靶序列所含的基因拷贝的绝对数目。随后，对其进行稀释， 制备每10 μ 1稀释液中含10,000拷贝、1，000拷贝、100拷贝、10拷贝、1拷贝的基因。此系 统的灵敏度为每个系统可检测单拷贝的23S rRNA基因。
[0029] 本发明的有益效果是：
[0030] 本发明根据衣原体23S rRNA基因的保守区域设计引物（2条上游引物和1条针对 所有11种衣原体的下游引物）和探针（3条探针）。总体的思路是：巧妙地设计PCR的引 物和探针，可以特异地扩增所有11种衣原体的核酸，并可依据熔解曲线T m值分型，适用于 大量临床样品的检测。
[0031] 1)本发明可以特异地检测所有11种衣原体。
[0032] 目前衣原体根据16S和23S rRNA基因序列的不同分为11种：肺炎衣原体 (C. pneumoniae)、沙眼衣原体（C. trachomatis)、鹤踏热衣原体（C. psittaci)、流产衣原体 (C. abortus)、家畜衣原体（C. pecorum)、鼠衣原体（C. muridarum)、猪衣原体（C. suis)、猫 衣原体（C.felis)、豚鼠衣原体（C.caviae)，及新发现的C. avium和C. gallinacea。所有 11种衣原体均可不同程度地感染哺乳动物、禽类和人类，因此，同时检测衣原体的所有种属 很重要，这将有利于发现新的衣原体种属，并及时更新衣原体的分类，从而更好地认识该病 原体。
[0033] 2)本发明可以对所有11种衣原体进行分型。
[0034] 依据其熔解曲线Tm值的不同，将11种衣原体分为8个类别，Tm值相近或重合的衣 原体种属可进行PCR产物测序，将测序结果与GenBank公布的衣原体23SrRNA基因序列进 行比对分析，确定具体种属。
[0035] 3)本发明操作便捷，适用于检测大批量样品。
[0036] 本发明可以快速、准确地检测所有11种衣原体，并能根据RT-PCR熔解曲线Tm值 的不同进行分型，操作便捷，且具有较高的特异性和灵敏度。我们对全国24个省市共4045 份禽类咽喉和泄殖腔拭子样品进行检测，结果显示本发明适用于临床大批量样品的检测。
【附图说明】
[0037] 图1是本发明所使用PCR系统的上游引物1
[0038] 上游引物 1 序列：5' -GGGGTTGTAGGGTCGATAAYATGRGATC-3'（28bp)。此引物序 列中有2个兼并碱