一种对微生物发酵法生产的n-乙酰神经氨酸进行分离提纯的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种对微生物发酵法生产的单体N-乙酰神经氨酸进行分离提纯的方法，属于生化分离工程技术领域。
【背景技术】
[0002]微生物发酵法生产N-乙酰神经氨酸，已有很多文献报道。申请号为201310600843.0的中国发明专利公开了利用大肠杆菌工程菌通过微生物发酵法生产N-乙酰神经氨酸的方法，该方法获得了含产物的发酵液。
[0003]虽然微生物发酵法生产N-乙酰神经氨酸的发酵方法和工艺已有很多报道，但对于下游阶段产物的分离提纯方法却鲜有报道，而下游的分离提纯方法和工艺直接决定了产品的品质和市场价格。目前市场需求领域如食品、保健和医药领域对N-乙酰神经氨酸产品品质要求较高，纯度均要求大于98%，而目前市场上纯度大于98%的产品价格非常昂贵，如Sigma公司销售的微生物发酵法来源的纯度98%的N-乙酰神经氨酸，售价约1000美元/克，即使是大众产品，98%的N-乙酰神经氨酸，售价也不低于6000元/千克。昂贵的价格和较高的品质需求，导致下游的分离提纯方法和工艺亟待研宄和开发。
【发明内容】
[0004]为避免上述现有技术所存在的不足之处，本发明的主要目的是提供一种对微生物发酵法生产的单体N-乙酰神经氨酸进行分离提纯的方法，旨在获得一种高纯度的质量稳定的N-乙酰神经氨酸，满足食品、保健、医药和化妆品等领域的应用需求。
[0005]本发明解决技术问题，采用如下技术方案:
[0006]本发明对微生物发酵法生产的N-乙酰神经氨酸进行分离提纯的方法，其特点在于按如下步骤进行:
[0007]a、以大肠杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的发酵液为原料，加入蒙脱石粉进行菌体絮凝沉淀，然后采用板框过滤器进行粗滤，对所得滤液进行离心分离，以去除发酵液中菌体，获得除菌发酵液；
[0008]b、在所述除菌发酵液中加入盐酸，调节pH至3.0?5.0，再在80?90°C条件下加热处理，以使杂蛋白沉淀，离心分离，去除杂蛋白沉淀，获得除蛋白发酵液；
[0009]C、利用活性炭或凹土对所述除蛋白发酵液吸附脱色，获得脱色发酵液；
[0010]d、使用离子交换树脂对所述脱色发酵液进行离子交换，去除所述脱色发酵液中的无机盐，获得除盐发酵液；
[0011]e、将所述除盐发酵液进行减压蒸发浓缩，然后在所得浓缩液中加入有机溶剂进行降温结晶，离心分离获得晶体；
[0012]f、洗涤所述晶体，利用真空程序升温干燥法对洗涤后晶体进行干燥，即完成对微生物发酵法生产的N-乙酰神经氨酸的分离提纯，获得产物N-乙酰神经氨酸。
[0013]本发明对微生物发酵法生产的N-乙酰神经氨酸进行分离提纯的方法，其特点也在于:步骤a所述蒙脱石粉为钙基蒙脱石；所述蒙脱石粉的加入量为所述发酵液质量的10 ?20% ；
[0014]步骤a所述板框过滤器中滤布孔径大小为1000?5000目。
[0015]步骤a所述的离心是通过管式高速离心机，以不低于1000rpm的转速进行离心，以使菌体沉淀。
[0016]步骤b所述的加热处理的时间不少于0.5h，以使杂蛋白彻底变性。
[0017]步骤c所述的活性炭或凹土的加入量为所述除蛋白发酵液质量的I %?5%，所述的吸附温度为20?50°C，所述吸附时间不少于0.5h。
[0018]步骤d所述离子交换树脂为阳离子交换树脂，优选为DOOl型阳离子交换树脂。
[0019]步骤e中所述浓缩液的浓度为100?200g/L ;所述有机溶剂为一元有机酸或一元醇和一元有机酸按体积比1:2?1:5构成的混合物；所述有机溶剂的加入量为所述浓缩液体积的2?5倍；所述降温结晶的温度为2?30°C，结晶时间为10?50h。
[0020]步骤f所述洗涤是以无水乙醇作为洗涤液进行洗涤；步骤f所述干燥是通过程序升温干燥法，在70?80°C真空烘干I?6h，再在80?90°C真空烘干I?6h。
[0021]本发明的技术效果体现在:
[0022]1、本发明根据蒙脱石粉能够絮凝菌体的性能，在大肠杆菌发酵液中加入少量蒙脱石，可以使菌体和蒙脱石粉迅速絮凝，利用板框分离即可达到很好的菌液分离效果，且对目标产物没有影响，分离前后发酵液中目标产物含量经高效液相色谱检测，几乎没有变化，如实施例1中证明了此效果；因大量菌体通过板框过滤除去后，就减轻了后续离心除菌体的压力，含少量菌体的发酵液通过高速离心，彻底分离菌体和液体，提高分离效率；
[0023]2、本发明在加热除杂蛋白前加入少量盐酸调节pH至3.0?5.0，然后在80?90 °C条件下加热，可彻底去除变性的杂蛋白。一般蛋白变性温度在70°C左右，但因大肠杆菌发酵液比较复杂，除蛋白温度至少在70°C以上，80?90°C热处理效果更好，能够彻底使发酵液中的蛋白变性，减少了结晶液中的杂蛋白，就提高了产品的纯度，实施例2和对比实施例3通过比较证明了此效果，同样条件下，当90°C热处理时，产品纯度是98.3%，而70°C热处理时，产品纯度是97.9% ；
[0024]3、因发酵液中含有少量的无机盐，采用离子交换法去除如钙、镁等阳离子盐，减少了结晶液中杂质含量，提高了产品纯度，实施例4和对比实施例5通过比较证明了此效果，同样条件下，除无机盐后结晶产品纯度是98.1%，未除无机盐结晶产品纯度是97.6% ;
[0025]4、本发明采用低温溶剂结晶法，既可以提高产品纯度，又可以提高产品收率，产品纯度98%以上，此结晶步骤收率90%以上；
[0026]5、本发明采用程序升温真空干燥法，既提高了产品纯度，又提高了干燥效率；干燥过程实际是物质的吸附和脱附过程，当吸附脱附达到平衡时，干燥速率就会变得很慢，此时如果打破吸附和脱附平衡，即可提高干燥效率；一般干燥方式都是恒温干燥，恒温干燥过程平衡很难打破，而采用程序升温干燥目的就在于打破此平衡，残留在固体内的溶剂很容易挥发出来，从而提高干燥后产品的纯度和干燥效率，实施例6和对比实施例7通过比较证明了此效果，同样条件下，90°C恒温真空干燥6h，纯度97.7% ;而程序升温干燥法，在80°C真空干燥3h，然后再90°C真空干燥2h，纯度是98.5% ；
[0027]6、经高效液相色谱法检测，本发明方法所得产品的纯度高于98%，满足市场需求，且成本低。
【附图说明】
[0028]图1为本发明实施例1所得产品的外观形态；
[0029]图2为本发明实施例1所得产品的高效液相色谱检测图谱。
【具体实施方式】
[0030]下面结合具体实施例进一步阐明本发明。但这些实施例仅用于说明本发明，而不构成对本发明范围的限制。
[0031]实施例1
[0032]本实施按如下步骤对微生物发酵法生产的N-乙酰神经氨酸进行分离提纯:
[0033]a、菌液分离:以申请号为201310600843.0的发明专利所公开的方法中，大肠杆菌基因工程菌发酵生产的含N-乙酰神经氨酸的发酵液为原料，加入占发酵液质量15%的钙基蒙脱石粉进行菌体絮凝沉淀，然后采用滤布孔径为2000目的板框进行挤压过滤，所得滤液通过管式高速离心机进行过滤，转速12000rpm，使菌体和发酵液彻底分离，获得除菌发酵液，经高效液相色谱检测，除菌前后发酵液中目标产物N-乙酰神经氨酸含量几乎没有变化，即采用蒙脱石粉絮凝菌体，不会对N-乙酰神经氨酸造成损失；
[0034]b、去除杂蛋白:在除菌发酵液中加入盐酸，调节pH至4.0，在85°C条件下加热0.5h，以使杂蛋白沉淀，离心分离，去除杂蛋白沉淀，获得除蛋白发酵液；
[0035]C、脱色:向除蛋白发酵液中加入占除蛋白发酵液质量4%的活性炭，在30°C条件下进行吸附脱色0.5h，获得脱色发酵液；
[0036]d、去除无机盐:将脱色发酵液缓缓进入DOOl型阳离子交换树脂柱，连续交换，去除除蛋白发酵液中的钙、镁等影响产品纯度的无机盐，获得除盐发酵液；
[0037]e、结晶:将除盐发酵液进行减压蒸发浓缩，浓缩至200g/L，然后在浓缩液中加入3倍体积的甲醇和乙酸(甲醇和乙酸的混合比是1:4)的混合溶剂，降温至10°C，结晶20h，得晶体；
[0038]f、洗涤、烘干:结晶好的晶体采用无水乙醇进行洗涤，然后进行程序升温真空干燥烘干，真空干燥方法是75°C真空烘干3h，然后升温至85°C再真空烘干4h，烘干后的晶体(外观形态如图1所示)采用高效液相色谱法检测(结果如图2所示)，纯度为98.2%。
[0039]实施例2
[0040]本实施按如下步骤对微生物发酵法生产的N-乙酰神经氨酸进行分离提纯:
[0041]a、菌液分离:以申请号为201310600843.0的发明专利所公开的方法中，大肠杆菌基因工程菌发酵生产的含N-乙酰神经氨酸的发酵液为原料