一种月季黑斑病菌的保存方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物真菌的保存方法，具体涉及一种月季黑斑病菌的保存方法。
【背景技术】
[0002]月季黑斑病是由蔷薇盘二孢(Marssonina rosae)引起的一种病害，是月季露地栽培最严重和最普遍的一种病害。该蔷薇盘二孢(Marssonina rosae)真菌的分离、纯化、繁殖和保存是开展月季种质资源黑斑病抗性鉴定、月季黑斑病菌毒性基因遗传学、病原和寄主互作关系和月季黑斑病菌生理小种分化等研宄工作的基础。现有技术的保存方法是将该菌接种到PDA培养基(土豆+葡萄糖+琼脂)上保存，一般可保存菌种3-5个月，持续保存需要每隔3-5个月重新更换培养基和重新接种。现有技术的保存方法不仅费时费力，而且菌种的致病力逐渐降低。因此，选择一种合适的月季黑斑病菌的保存方法势在必行。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种能够使月季黑斑病菌保存时间更长，同时仍能保持强有力的致病力，方法更简单、更能增加实用性的月季黑斑病菌的保存方法。
[0004]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0005]一种月季黑斑病菌的保存方法，包括以下步骤:
[0006](I)月季黑斑病菌的分离和纯化培养
[0007]①将感染了黑斑病菌的月季叶片放入体积分数为70%乙醇溶液20s，再用无菌蒸馏水清洗2-3次，展开叶片将其平铺在盛有质量分数为I %琼脂的培养皿中，在室内光照强度为1800-32001x，光周期为10-16h光期、8-14h暗期，空气相对湿度90-100 %，室温18-28°C的条件下培养24-48h ；
[0008]②在解剖镜下用已灭菌的挑针从培养皿中分离出单个的萌芽真菌孢子，将其转移到盛有营养培养基的培养皿中，在室内黑暗条件下，且空气相对湿度90-100%，室温为18-28°C培养4-5周，所述的营养培养基由以下重量份的成分混合而成:麦芽3.5份、酵母2份和琼脂2份；
[0009](2)月季黑斑病菌的活力性检测
[0010]用无菌蒸馏水将步骤(I)②培养皿中的营养培养基洗掉，保留培养皿中的真菌菌落并转移到离心管中，在3000-5000转/分的条件下离心10-15min，将上清液转移到已灭菌的容器内，每次取出上清液lml，用质量分数为0.07%的酚藏花红溶液进行真菌孢子的活力性检测，有活力的孢子不变色，失去活力的孢子变红，当孢子活力性检测值小于90%时，说明孢子活性不够，继续维持步骤(I)②所述培养至检测出孢子活力性检测值大于或等于90%，当孢子活力性检测值大于或等于90%时，将容器内上清液中的孢子浓度用无菌水调至1 X 105-2X 106个/ml用于接种备用；
[0011](3)月季黑斑病菌的繁殖和保存
[0012]①繁殖:用喷雾法或滴液法将步骤(2)检测得到的孢子活力性检测值大于或等于90%，且该孢子溶液浓度调至1 X 105-2X 106个/ml的孢子接种到经消毒处理的对月季黑斑病敏感的月季品种的离体叶片上或接种到经消毒处理的对月季黑斑病敏感的月季野生种的离体叶片上，将接种后的离体叶片平铺于保湿的培养皿中，在室内光强1800-32001x、光周期为10-16h光期、8-14h暗期，空气相对湿度90-100%，室温18_28°C的条件下培养7-14d;所述保湿的培养皿为将已灭菌的棉花平铺于培养皿中，在棉花上滴加1ml的无菌水；
[0013]②保存:
[0014]取出步骤(3)①培养皿中的离体叶片，用无菌滤纸吸干该叶片表面的水分后装入容器中，立刻将该容器放入液氮中速冻5-15min后，取出再放入_70°C?_80°C的超低温冰箱保存；
[0015](4)月季黑斑病菌的复活
[0016]从超低温冰箱中取出容器立刻放入4°C的环境中，待解冻后，将容器内的离体叶片平铺于保湿的培养皿中，在室内光强1800-32001x、光周期为10-16h光期、8-14h暗期，空气相对湿度90-100%、室温18-28°C的条件下培养以备用；所述保湿的培养皿与步骤(3)①所述的保湿的培养皿的保湿方式相同。
[0017]进一步，步骤(3)①繁殖中所述的消毒处理是:采集对月季黑斑病菌敏感的月季品种完全展开的无病虫害的叶片或对月季黑斑病菌敏感的月季野生种的完全展开的无病虫害的叶片，先将采集的叶片进行解剖镜镜检，确保所采集的叶片无任何真菌菌落或菌丝后，用质量分数为0.8%的次氯酸钠处理20s，再用体积分数为70%乙醇处理20s，然后用无菌的蒸馏水清洗2-3次，用无菌的滤纸吸干叶片表面的水分。
[0018]与现有技术相比，本发明的主要创新点和有益效果是:
[0019]1、本发明所述月季黑斑病菌的分离和纯化培养步骤的参数能使月季黑斑病菌生理小种得到很好的分化和纯化培养，能准确地分离出月季黑斑病菌的某一个生理小种。而现有技术不能提供这些参数，几乎忽略了此步骤的重要性，因而不能很准确地分离出月季黑斑病菌的某一个生理小种，病菌生理小种的混合保存法将不利于后续的不同生理小种分化和抗性鉴定等实验的开展和深入。
[0020]2、本发明中月季黑斑病菌的保存介质是对月季黑斑病敏感的月季叶片，其效果是保存时间更长，保存期间无须额外的重新更换培养基和重新接种等繁杂的步骤。而现有技术保存介质是PDA培养基(土豆+葡萄糖+琼脂)，只能保存菌种3-5个月，持续保存需要每隔3-5个月重新更换培养基和重新接种，不仅费时费力，而且菌种的致病力逐渐降低。
[0021]3、本发明对孢子活力性的检测和范围值在接种保存前进行了实施和规定，其效果是月季黑斑病菌在_80°C冰箱中保存3年后，其活力依然很强，其致病力保持不变，致病力达到100%。
[0022]综上所述，本发明方法各步骤的协同作用，使月季黑斑病菌的保存期延长至3年，其保存期比现有技术增长6.2-11倍，且保存36个月后，其病菌活力仍达到于90 %以上，比现有技术保存的病菌活力提高100%，病菌致病力提高100%，产生了预料不到的技术效果O
【具体实施方式】
[0023]以下实施例无特殊说明为常规方法。
[0024]实施例1 (本发明方法)
[0025](I)月季黑斑病菌的分离和纯化培养
[0026]①将感染了黑斑病菌的月季叶片放入体积分数为70%乙醇溶液20s，再用无菌蒸馏水清洗3次，展开叶片将其平铺在盛有质量分数为I %琼脂的培养皿中，在室内光照强度为20001x、光周期为16h光期、8h暗期，空气相对湿度95%、室温23°C的条件下培养36h ；
[0027]②在解剖镜下用已灭菌的挑针从培养皿中分离出单个的萌芽真菌孢子，将其转移到盛有营养培养基的培养皿中，在室内黑暗条件下，且空气相对湿度95%、室温23°C培养5周，所述的营养培养基由以下重量份的成分混合而成:麦芽3.5份、酵母2份和琼脂2份；
[0028](2)月季黑斑病菌的活力性检测
[0029]用无菌蒸馏水将步骤(I)②培养皿中的营养培养基洗掉，保留培养皿中的真菌菌落并转移到离心管中，在4000转/分的条件下离心12min，将上清液转移到已灭菌的容器内，每次取出上清液lml，用质量分数为0.07%的酚藏花红溶液进行真菌孢子的活力性检测，有活力的孢子不变色，失去活力的孢子变红，当孢子活力性检测值小于90%时，说明孢子活性不够，继续维持步骤(I)②所述培养至检测出孢子活力性检测值大于或等于90%，当孢子活力性检测值大于或等于90%时，将容器内上清液中的孢子浓度用无菌水调至1 X 105-2X 106个/ml用于接种备用；所述质量分数为0.07%的酚藏花红溶液的配制是:0.07g酚藏花红溶解于10ml无菌水。
[0030](3)月季黑斑病菌的繁殖和保存
[0031]①繁殖:用喷雾法或滴液法将步骤(2)检测得到的孢子活力性检测值大于或等于90 %，且该孢子溶液浓度调至I X 105-2 X 16个/ml的孢子接种到经消毒处理的对月季黑斑病敏感的月季品种‘云彩虹’的离体叶片上，将接种后的月季离体叶片平铺于保湿的培养皿中，在室内光强20001x、光周期为16h光期、8h暗期，空气相对湿度95%、室温23°C的条件下培养14d ;所述保湿的培养皿为将已灭菌的棉花(棉花厚度为0.5cm)平铺于培养皿中，在棉花上滴加1ml的无菌水；对月季黑斑病敏感的月季品种‘云彩虹’的离体叶片的消毒处理是:采集对月季黑斑病菌敏感的月季品种‘云彩虹’完全展开的无病虫害的叶片，先进行解剖镜镜检，确保所采集的叶片无任何真菌菌落或菌丝后，用质量