一种抗肿瘤t细胞、其制备方法和抗肿瘤药物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种抗肿瘤T细胞及其制备方法，W及W该抗肿瘤T细胞为活性成分 的抗肿瘤药物或接种疫苗。
【背景技术】
[0002] 直接使用体外扩增抗肿瘤T细胞基于两个事实；1)有恶性脑肿瘤的患者具有很 强的系统性免疫抑制，严重地阻碍了接种抗肿瘤疫苗方法的效果；2)与接种疫苗方法相 比，使用包括肿瘤浸润淋己细胞（tumor infiltrated lympho巧tes, TIL)或基因工程外周 血淋己细胞（peripheral blood lympho巧tes,PBL)在内的体外扩增抗肿瘤T细胞的过继 细胞转移（adoptive cell transfer, ACT)能更有力地根除黑素瘤患者中残存的肿瘤细胞 (Dudley ME, Yang JC, Sherry R, Hu曲es MS, Royal R,et al. (2008) Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma:evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens. J Clin Oncol 26:5233-5239 ；Morgan RA, Dudley ME, Wunderlich JR, Hughes MS, Yang JC, et al. (2006)Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes. Science 314:126-129)，并彻 底移除血液中及转移的肿瘤细胞（Porter DL Levine BLKalos M，Bagg A,化ne CH(2011) Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New Elngland journal of medicine 365:725-733)。然而，该两种体外产生抗肿瘤 T 细胞 的方法不可避免地面对某些明显的限制。经TCR或CAR的基因工程修饰的T细胞只能祀向 杀伤一种肿瘤抗原，而该种单一的祀向杀伤最终会由于肿瘤抗原的改变带来的治疗失败。 而TIL代表多功能抗肿瘤T细胞，它的成功应用仅限于黑素色瘤。由于切除的肿瘤样本的 尺寸很小，可W获得的TIL有限，所W没有应用TIL治疗恶性脑肿瘤的临床数据。有趣的 是，在最近报道的519例恶性胶质瘤中患者发现，CD8T细胞的浸润与患者的长期存活有关 (Yang IjTihan T, Han SJ, Wrensch MR, Wiencke J, et al. (2010) CD8+T-cell infiltrate in newly diagnosed glioblastoma is associated with long-term survival. J Clin Neurosci 17:1381-1385)。由于实际临床治疗中存在着在脑肿瘤中获取TIL的困难，有必 要寻求其它的方法获取类似TIL的抗肿瘤T细胞。
【发明内容】
[0003] 本发明为解决现有技术中的上述问题而提出的。本发明使用ttRNA(肿瘤总RNA) 负载的树突细胞（demlritic cells, DC)作为平台体外扩增类似TIL的多祀点抗肿瘤T细 胞，实现体外扩增少量ttRNA至足够的量而用于临床应用，并评价其在顾内（1C)荷瘤小鼠 模型中的协同抗肿瘤效果。
[0004] 本发明提供了一种抗肿瘤T细胞及其制备方法。
[0005] 本发明还提供了一种W上述抗肿瘤T细胞为活性成分的抗肿瘤药物。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用W下技术方案：
[0007] 本发明的第一个方面是提供一种抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述抗肿瘤T细胞是 W肿瘤总RNA负载的树突状细胞DC特异性扩增和富集抗肿瘤T细胞。
[000引在上述抗肿瘤T细胞中，优选地，所述抗肿瘤T细胞中还包括细胞因子，所述细胞 因子优选自但不限于IL-4、比-7、IL-12、IL-15、IL-21、GM-CSF、CD40L中的任意一种或多种 组合，更优选为比-7、比-12、比-21的组合。
[0009] 在上述抗肿瘤T细胞中，优选地，所述树突细胞来自人类或鼠的髓细胞或淋己细 胞。
[0010] 本发明的第二个方面是提供如上述抗肿瘤T细胞的制备方法，包括如下步骤：
[0011] 步骤1、肿瘤总RNA的制备；来自经细胞培养的肿瘤细胞经体外合成为肿瘤总 RNA ；
[0012] 步骤2、成熟肿瘤总RNA-DC的制备；将步骤1得到的肿瘤总RNA与分离的树突细 胞DC通过电转导的方式导入DC内，随后在培养基中培养过夜，得到成熟的肿瘤总RNA-DC ;
[0013] 步骤3、将步骤2得到的成熟肿瘤总RNA-DC与T细胞共培养，得到如权利要求1 所述的抗肿瘤T细胞。
[0014] 在上述制备方法中，优选地，所述步骤1的肿瘤细胞系来自人类或鼠的肿瘤细胞， 更优选自但不限于具有高度侵袭力的鼠的星形细胞瘤细胞系KR158和黑色素瘤细胞系 B16F100VA。
[0015] 在上述制备方法中，优选地，所述步骤2的树突细胞来自人类或鼠的髓细胞或淋 己细胞。
[0016] 在上述制备方法中，优选地，所述步骤2在培养基中加入CD40L或脂多糖LI^S来实 现DC的成熟。
[0017] 在上述制备方法中，优选地，所述步骤3的共培养在细胞因子的存在下进行；更优 选地，所述细胞因子选自IL-4、比-7、IL-12、IL-15、IL-2UGM-CSF、CD40L中的任意一种或 多种组合；最优选地，所述细胞因子选自比-7、比-12、比-21的组合。
[001引在上述制备方法中，优选地，所述步骤3的T细胞来自人类或鼠的脾脏，更优选地 来自人类或鼠的脾脏。
[0019] 在上述制备方法中，优选地，所述步骤3的T细胞为抗原应答细胞，包括CD4+T细 胞、CD8+T细胞、效应T细胞、记忆T细胞。
[0020] 在上述制备方法中，优选地，所述步骤3的成熟ttRNA-DC与T细胞的数量比为1 ; (15-25)，例如 1 ;20。
[0021] 本发明的第=个方面是提供一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物W权利要求1所述 的抗肿瘤T细胞为活性成分。
[0022] 在上述抗肿瘤药物中，优选地，所述抗肿瘤药物为药剂或接种疫苗。
[0023] 在上述抗肿瘤药物中，优选地，所述肿瘤包括例如脑癌的肿瘤。
[0024] 负载有总肿瘤抗原的DC提供所有需要W满足体外富集和扩增抗肿瘤T细胞。DC 是强有力的刺激细胞，不断地监督宿主的抗原环境并特异性地活化T细胞和B细胞应答 (Steinman RM(2001)Dendritic cells and the control of immunity:enhancing the efficiency of antigen presentation. The Mount Sinai journal of medicine. New York 68:160-166 ;Banchereau J, Steinman RM(1998)Dendritic cells and the control of immunity. NaUire 392:245-252)。使用加载有多版或肿瘤抗原提取物的DC的免疫 疗法已经证明在脑肿瘤具有强有力的抗肿瘤活性（Iwami K，Shimato S，化no M，0kada H, Nakahara N, et al. (2012)Peptide-pulsed dendritic cell vaccination targeting interleukin-lSreceptor alpha2chain in recurrent malignant glioma patients with HLA-A*24/A*02allele. Cytotherapy 14:733-742 ;Yu JS,师eeler CJ,Zeltzer PM，Ying H, Finger DN, et al. (2001)Vaccination of malignant glioma patients with peptide-pulsed dendritic cells elicits systemic cytotoxicity and intracranial T-cell infiltration. Cancer research 61:842-847 ；Liau LM，Black KL,Prins RM, Sykes SN, DiPatre PL,et al. (1999)Treatment of intracranial gliomas with bone marrow-derived dendritic cells pulsed with tumor antigens. Journal of neurosurgery 90:1115-1124 ；Labour MS,民oters B,Pers B,Mehling A,Luger TA, et al. (1999)Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage.Journal of immunology 162:168-175)。有趣的是，发明人发现，在协同作用的肿瘤荷瘤模型中，负载肿瘤裂解产物 的DC做为接种疫苗已显示出强烈的保护和治疗作用，并且发现DC的成熟状态直接关系到 抗肿瘤免疫的效果；数据建议临床使用成熟的、而不是不成熟的肿瘤抗原负载DC作为有效 的肿瘤接种疫苗。由于代表臥RNA形式的肿瘤细胞的总抗原的ttRNA容易使用，本发明提供 了一个创新方法使用ttRNA-DC作为主要平台体外产生多功能抗肿瘤T细胞。在本发明中， 代替肿瘤裂解产物作为肿瘤抗原的来源，基于切除的来自脑肿瘤的肿瘤样本很小而不足臥 产生肿瘤裂解细胞这个事实，所臥发明人使用ttRNA负载DC。而且，发明人已经建立标准的 操作流程（SCP)实现体外扩增少量ttRNA而达到足够用于临床应用的方案。因此，在本发 明中，基于ttRNA-DC作为治疗接种疫苗，发明人提高它的治疗潜力，直接体外产生抗肿瘤T 细胞用于创新的肿瘤免疫治疗。
[0025] 为使用过继细胞疗法（ACT)用于癌症治疗，一个实际考量是T细胞在体外培养 过程中的逐步终末分化，该分化产生强的体外效应抗肿瘤活性，但却相反地大大地降低 了体内的抗肿瘤效果（Gattinoni LKlebanoff CA, Palmer DC, Wrzesinski C，Kerstann K, et al. (2005)Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells. The Journal of clinical investigation 115: 1616-1626)。T 细胞的分化状态可 臥直接被下列因素调整；1)培养的过程；2)药物的加入；臥及3)体内使用组合细胞因 子(Gattinoni L,Klebanoff CA, Palmer DC,Wrzesinski C,Kerstann K,et al. (2005) Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+T cells. The Journal of clinical investigation 115:1616-1626 ;Gattinoni L, Klebanoff CA,民estifo NP(2009) Pharmacologic induction of CD8+T cell memory:better living through chemistry. Science translational medicine ;Hinrichs CS,Spolski 民，Paulos CM, Gattinoni L, Kerstann KW,et al. (2008)IL-2and IL-21confer opposing differentiation programs to CD8+T cells for adoptive immunother