一种放射性核素标记的microRNA-155靶向探针及其在肿瘤显像的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及一种放射性核素标记的microRNA-155祀向 探针及其在肿瘤显像的应用。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是一类严重危害人类身体健康的疾病。据统计，我国每年新增肿瘤患者 约160万人，每年因肿瘤死亡的人数约130万人。肿瘤的早期诊断，可W使患者得到及时治 疗，提高治愈率、改善预后、降低死亡率，因而早发现、早诊断、早治疗的早"原则在肿瘤 诊治中受到广泛重视，一直是肿瘤研究的热点课题。在众多诊断手段中，核医学的放射性核 素示踪技术W其高灵敏性、无创性、活体动态监测等优势独树一峽。特别是近年来分子核医 学的不断发展，在细胞水平、甚至基因水平利用放射性核素示踪技术对特定分子进行探测， 具有无创、早期、动态、定性/定量诊断等优势。研发具有高特异性、高灵敏度、强应用性的 分子探针，实现疾病的早期诊断是分子核医学领域的前沿热点课题。
[0003] microRNA(miRNA)是一类小分子量的非编码RNA，一般为20~24个核巧酸，通过 与祀基因的3'端非编码区域互补配对，使翻译受到抑制或引起特异性降解，从而在转录后 水平进行调控。当某些miRNA由于基因扩增、缺失、变异等原因发生表达失调（增多或减少） 时，可W导致恶性肿瘤的发生。该类miRNA已被证实扮演着原癌基因和抑癌基因的角色。原 癌miRNA在大量的实体和血液恶性肿瘤中高表达，可W引起正常细胞发生恶变或增加肿瘤 细胞的侵袭性和转移性。众多研究表明，miRNA可作为一种新的肿瘤标志物，在肿瘤组织的 特异性变化可W帮助恶性肿瘤的早期诊断、进展评价、预后判断、W及治疗评估，甚至miRNA 本身亦可作为治疗药物。
[0004] microRNA-155 (miR-155)是第一个被发现具有癌基因功能的miRNA,定位于染色 体21q23中的B细胞整合簇炬cell integration cluster，BIC)的非编码区，参与分化、造 血、炎症、调亡和免疫过程，特别是与多种恶性肿瘤、屯、血管疾病和病毒感染有关。miR-155 的祀基因预计约991种，编码转录调控蛋白、蛋白受体、激酶、核和DM结合蛋白，如C/ EBP 0、E2F2、切clinD、PIK3R1、S0SC1、K-ras 及 TGF，通过 MAPK，ErbB，mTOR 和 VEGF 等影响 细胞增殖、分化和调亡的细胞信号通路。众多研究证实，miR-155显著高表达于乳腺癌、肺 癌、结肠癌、膜腺导管癌、甲状腺癌、淋己瘤等多种恶性肿瘤，在肿瘤发生、发展、侵袭及转移 中发挥重要的作用，且与患者预后息息相关。恶性肿瘤组织中的miR-155可达正常组织的 10-14倍。体外细胞实验表明，miR-155在MDA-MB-453乳腺癌细胞中可W抑制caspase-3 活性，阻止调亡。高表达的 miR-155 常伴随 tumor protein 53-induced nuclear protein UTP53INP1)降低，该因子可W阻滞细胞周期并激活caspase-3诱发调亡。在胃癌研究中， 过表达的miR-155祀向作用于信号传导蛋白SMAD2抑制细胞的迁移、侵袭和粘附。在肝癌研 究中，能通过活化Wnt信号显著抑制调亡，促进肝癌细胞增殖，还可直接祀向作用于S0X6， 下调p21wafl/cipl通路，或祀向作用于C/EBP0，增加细胞增殖和肿瘤形成。高表达的 miR-155通过祀向下调调亡诱导基因TP53INP1的表达促进PDAC的发生。miR-155在结肠 癌细胞中的表达，继而下调祀点S0SC1的表达，促进小鼠肿瘤的生长。miR-155在TGF-0 / Smad2信号通路中受到调控，与化oA祀向作用后，在乳腺癌的发生发展中发挥作用。高度表 达的miR-155,通过抑制化oA的活性，干扰细胞的紧密结合的形成，进而促使细胞迁移和侵 袭。由此可见，miR-155作为一种多种恶性肿瘤显著高表达的肿瘤相关生物标志物，可W作 为肿瘤相关的作用祀点。检测恶性肿瘤中miR-155的表达水平对肿瘤的特异诊断、早期预 警、预后评价、疗效评估与治疗指导等方面具有重要的临床应用价值。
[0005] 然而，目前针对miR-155在体内水平的检测方法均为肿瘤活检组织的离体测定， 如miRNA基因巧片技术、nodhern blotting检测、实时定量PCR(RT-PCR)分析、免疫组织 化学方法等等。该些检测方法存在W下问题；有创性，需要穿刺活检组织或手术切除病变， 且操作过程较为繁琐，结果有赖于病理组织的有效选取，存在一定的假阴性率。因此，miRNA 的组织检测不能满足早期诊断的需要，不适于广泛的筛查和预防。有必要发展一种能活体 检测miRNA表达的方法。
[0006] 反义核巧酸能够与序列互补的miRNA发生特异性的结合，利用该一特点，设计和 合成互补的反义寡核巧酸，进行适当的化学修饰，使之能在血清中保持良好的稳定性，进而 在体内与互补的miRNA进行特异性的结合。将放射性标记方法与反义理论相结合，得到放 射性核素反义示踪技术。肿瘤反义基因显像选择肿瘤特异的miRNA分子为祀向，对其特异 性结合的探针进行放射性标记，利用单光子发射显像设备（SPECT)或正电子发射断层显像 (PET)等多种检测手段，显示反义探针的体内分布，定性或定量地评价在肿瘤的浓聚水平。 反义显像方法相比体外活检方法，最大优势就是避免了检查的创伤性，实现了无创、活体、 实时的肿瘤分子显像，不受活检标本取材的限制，对生物体进行整体全面的评价，避免了假 阴性结果。
[0007] 随着对miRNA在恶性血液病中的作用的深入研究，针对miRNA合成的反义寡核巧 酸，有望成为肿瘤治疗的祀点。miR-155作为癌基因促进多种恶性疾病的发生、发展的潜在 祀标，已被报道在体外细胞和组织中用于肿瘤祀向治疗研究。miR-155的反义寡核巧酸在治 疗神经胶质瘤中，增加GABRA1蛋白的表达，抑制恶性细胞的增殖。在乳腺癌者中恢复S0CS1 蛋白的表达，抑制肿瘤生长。在小鼠或猴子模型体内实验中，反义寡核巧酸祀向结合特异性 miRNA可通过抑制miRNA发挥作用，证实反义探针具有结合的特异性和可靠性。
[000引祀向核酸分子能否与祀基因特异性结合，是祀向显像技术成功与否的关键。反义 核酸与祀点的结合，根本上取决于有效反义寡核巧酸序列的确定。未修饰的核酸分子在体 内或血清环境下容易发生降解进而导致活性丧失，必须要使用一定的化学修饰方法来保证 寡核巧酸的生物稳定性。目前关于核酸分子的化学修饰方式主要包括2'糖基修饰（包括 2' -0-methyl，2，-0Me ;2' -0-methox;yethyl，2，-M犯；2' -flouro,2，-巧、锁核酸（locked nucleic acid, LNA)和磯酸骨架修饰（phosphorothioate baclcbone modification, P巧。 合适的化学修饰不但能够提高核酸探针与祀向RNA的杂交亲和力，提高其抵抗核酸酶降解 的能力，而且还可W减缓核酸探针的血浆清除速度并提高进入组织的能力。LNA修饰或肤核 酸修饰的核酸探针通过抑制miR-155,用于治疗实体和血液系统恶性肿瘤，均取得了良好效 果。W上研究为核酸标记探针的祀向显像研究提供了理论依据。
【发明内容】
[0009] 本发明的一个目的是提供一种microRNA-155祀向探针A。
[0010] 本发明提供的microRNA-155祀向探针A，为单链DM分子，其核巧酸序列为序列 2,且序列2的第一位核巧酸通过己基连接伯胺，序列2第1-6位核巧酸和第18-23位核巧 酸均经硫代修饰，第1-3位核巧酸和第21-23位核巧酸均经2' -甲氧基修饰。
[0011] 本发明的另一个目的是提供一种microRNA-155祀向探针B。
[0012] 本发明提供的microRNA-155祀向探针B，为用放射性核素标记所述祀向探针A，得 至Ij microRNA-155 勒1 向探针 B。
[0013] 上述microRNA-155祀向探针B中，所述放射性核素为99-Tc。
[0014] 上述microRNA-155祀向探针B中，所述放射性核素是通过聲合剂NHS-MAG3标记 到所述标记所述祀向探针A。
[0015] 本发明的第S个目的是提供一种显像剂。
[0016] 本发明提供的显像剂，其活性成分为上述的祀向探针A或上述的祀向探针B。
[0017] 或本发明提供了 microRNA-155作为肿瘤显像剂祀点中的应用。
[001引上述的祀向探针B在制备显像剂中的应用也是本发明保护的范围。
[0019] 上述显像剂为肿瘤影像显像剂。
[0020] 本发明的第四个目的是提供一种制备祀向探针B的方法。
[0021] 本发明提供的方法，包括如下步骤：
[002引 1)将上述的祀向探针A和NHS-MAG3溶液混匀，馨合反应，收集反应产物，即得到馨 合后祀向探针A ;
[0023] 2)将所述馨合后祀向探针A和放射性核素在含有氯化亚锡和酒石酸钢的反应体 系中反应，得到祀向探针B。
[0024] 上述馨合反应在常温静置化的条件下进行；
[002引 NHS-MAG3中的MAG3和祀向探针A(AAM-155)的摩尔比为15:l-20:l，具体为20:l。
[0026] 上述含有氯化亚锡和酒石酸钢的反应体系按照包括如下步骤的方法制备：
[0027] 将SnCl2溶液、浓度为50mg/ml、抑值为9. 2的酒石酸钢缓冲液混匀得到含有氯化 亚锡和酒石酸钢的反应体系，其中，SnCl2溶液与酒石酸钢缓冲液的体积比为1:5。
[00測上述SnCl2溶液为将维生素C溶于lOmM的肥1中，配制浓度为1. Omg/ml维生素 C肥1溶液，将SnC12与新鲜配制的维生素盐酸溶液混匀，得到SnCl2溶液，且SnCl班SnCl 2 溶液中的终浓度为4mg/ml ;