一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程的动物生物技术，特别是水牛繁殖与定向遗传改良领域；具体涉及一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法。
【背景技术】
[0002]转基因动物是指将特定的外源基因导进动物受精卵或胚胎，使之稳定整合于动物的染色体基因组并能遗传给后代的一类动物。其主要特点是人类有目的的、有计划、有根据、有预见的改变动物的遗传结构，而赋予转基因动物新的表型特征。
[0003]水牛是我国南方一种极具开发前景的重要家畜，因其适应性强、耐高温高湿、抗病力强、耐粗饲、容易饲养、使用年限长和乳品营养价值高等特性，而倍受人们关注与重视。然而，目前我国水牛品种的产奶量和繁殖率低，严重制约水牛奶业的发展，急需应用基因工程技术对其进行改良，克隆技术可为此提供平台。
[0004]克隆是英文“clone”的音译，是指一个动物经无性繁殖可孤雌生殖产生的后代，克隆的所有后代的遗传组成是完全相同的，又称无性繁殖细胞系。目前体细胞克隆的方法有显微操作核移植和手工克隆。
【发明内容】
[0005]显微操作核移植是通过显微操作去核，电融合等实验室手段，将核供体细胞与去核的卵母细胞受体胞质进行体外重构。相比于显微核移植技术，手工克隆不需要借助于昂贵的显微操作系统，操作过程简单、快速且后期的囊胚发育率高。所以手工克隆技术更适宜用于大批量生产体细胞克隆水牛胚胎。但是，手工克隆在操作过程中，水牛卵母细胞需消化透明带，其去核方法、融合参数与显微操作核移植有较大差异，且颗粒细胞共培养的胚胎培养体系也无法支持无透明带克隆胚胎的发育。为此，本发明摸索了新的去核方法、手工克隆过程中的相关参数，以及完善了胚胎培养液，建立一种稳定的采用采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法。
[0006]为了提供一种稳定的利用手工克隆技术生产水牛转基因克隆胚胎方法，本发明的目的在于公开了一种采用采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法。
[0007]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0008]一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法，包括下述步骤:
[0009](I)、用于构建转基因克隆胚胎的转外源基因水牛胎儿成纤维细胞(BFF)的制备；
[0010](2)、用于构建转基因克隆胚胎的受体卵胞质的制备；
[0011](3)、水牛转基因克隆重构胚的构建:步骤(2)的受体卵胞质与步骤(I)的转外源基因增强绿色荧光蛋白(EGFP)的水牛胎儿成纤维细胞供体细胞经植物凝集素作用粘合形成半卵-供体-半卵复合体；并采用一步融合法，通过100V/mm直流电波、脉冲时间10 μ S、2次脉冲进行电融合以构建得到采用手工克隆技术构建的水牛转基因克隆重构胚；
[0012](4)、水牛转基因克隆重构胚的培养:水牛转基因重构胚经5 μ mol/L离子霉素处理5min，再用2mmol/L的6- 二甲氨基嘌呤培养3h进行化学激活处理后，置于含有混合培养液的微穴中培养6-7天，可获得发育到囊胚阶段的水牛转基因克隆胚胎，其中混合培养液是由RVCL液与SOF液以体积比1:1混合。
[0013]上述技术方案所述的一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法，其中，步骤(I)的具体过程为:
[0014](A)、采用组织块培养法将剪碎的水牛胎儿的耳部皮肤组织均匀地平铺于60_的皿底，加入10% FBS的DMEM培养液1ml，轻轻移入38.5°C，5% 0)2和100%湿度的培养箱中培养5h，待组织块贴壁后，再加入3ml含10% FBS的DMEM培养液，进行原代培养，每隔2?3d换一次液；
[0015](B)、待原代细胞长到80?90%汇合时，开始进行细胞传代:采用常规的细胞传代方法，先用无Ca2+、Mg2+的PBS洗两遍，加入3ml含0.25%胰蛋白酶的Hank’ s液消化3?5min，待细胞变圆时，小心吸出消化液，再加入3ml含10% FBS的DMEM培养液终止消化；弃去皿内组织块，用吸管轻轻吹打使细胞悬浮，收集悬浮液于5ml离心管，采用1200rpm离心5min，重悬液以IXlO6细胞/ml接种于含有10% FBS的DMEM培养液的新的培养皿中，放入38.5°C,5% 0)2和100%湿度的培养箱中培养；此后每隔3?4d传一代，传代比例约为1:3 ；
[0016](C)、使用采用电穿孔转染法将线性质粒pCE-EGFP-1RES-neo转染到第3代的水牛胎儿成纤维细胞:将第3代的水牛胎儿成纤维细胞接种到含10% FBS的DMEM培养液中置于38.5°C,5% 0)2和100%湿度的培养箱内培养3天；转染前用含0.25%胰蛋白酶的Hank’s液消化3?5min，直到大部分细胞变圆后，加入等体积的含10% FBS的DMEM液终止消化，然后收集细胞，并加入PBS液制成1fVmL的细胞悬液转移至0.4cm的电击杯中，同时加入10 μ g线性质粒pCE-EGFP-1RES-neo混匀后，室温放置5min ;使用电融合仪在150V、10ms、I次脉冲的条件下进行电击，电击后冰上放置5min，再接种至含10% FBS的DMEM培养液的培养皿中培养，待细胞生长状态恢复，加入600 μ g/ml G418进行抗性细胞筛选7天后再用200ng/ μ I G418筛选7天，每3?4d换液一次，挑取细胞数超过60个的细胞集落进行扩大培养后作为构建水牛转基因克隆胚胎的供体细胞。
[0017]上述技术方案所述的一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法，其中，步骤(2)的具体过程为:
[0018](a)、从屠宰场收集的水牛卵巢上抽取卵母细胞经体外成熟培养22_24h ；
[0019](b)、去除卵母细胞周围的卵丘细胞后，经0.5 μ g/ml秋水仙胺处理15分钟，2mg/ml链蛋白酶消化8分钟去除透明带；
[0020](C)、去除透明带的卵母细胞放置于操作液滴中，于体视显微镜下利用手工克隆专用切割刀将卵母细胞的凸起部分及1/3的胞质切掉以去核，所述操作液滴为含有5mg/L细胞松弛素B的M199基础液；
[0021](d)、去核的卵母细胞移入SOF培养液中，放入胚胎培养箱中恢复培养30min，作为构建水牛转基因克隆胚胎的受体卵胞质。
[0022]上述技术方案所述的一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法，其中，步骤(3)的具体过程为:
[0023]( i )、步骤(I)中培养的转外源基因EGFP的BFF培养皿中DMEM液体吸掉，用无血清的PBS清洗2次，经0.25%胰蛋白酶的Hank’ s液消化3?5min后，收集获得的细胞放置于含有0.0lg/ml PVA的SOF培养液滴中沉降5?8min ;步骤(2)中的一部分去核半卵放置于含0.5mg/ml植物凝集素PHA的SOF培养液微滴中处理5_10s，然后将经植物凝集素PHA处理的去核卵母细胞移至放置有供体细胞的含0.0lg/ml PVA的SOF培养液滴中，使用捡卵针吹动受体去核半卵使之与单个供体细胞接触粘合，形成供体-半卵复合体；步骤(2)中的另一部分去核半卵放置于含有0.5mg/ml植物凝集素的SOF培养液滴中处理5_10s，然后移入含有供体-半卵复合体的含0.0lg/ml PVA的SOF培养液滴中，用捡卵针吹动其中一个半卵将其与供体-半卵复合体粘合成串，使半卵-供体-半卵三者呈直线排列，形成半卵-供体-半卵复合体，最后将这种半卵-供体-半卵复合体移入SOF液中恢复培养以进一步进行电融合；
[0024]( ii )、采用一步融合法进行电融合:粘合后的半卵-供体-半卵复合体先在Iml由0.28mol/L 甘露醇、0.1mmol /T, CaCl2、0.1mmol /T, MgS04、5mmol/L Hepes、0.1 % BSA 和 5mg/L酚红组成的融合液中放置2min，而后将其移入显微操作仪上两电极间的100 μ I融合液的微滴中，用其中一根铂金丝轻轻拨动细胞调整位置，在100v/mm、10yS条件下、2次电脉冲进行融合，将电刺激后半卵-供体-半卵复合体移入SOF液中，置于胚胎培养箱中恢复培养30min，使细胞相互融合。
[0025]上述技术方案所述的一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法，其中，步骤(4)的具体过程为:
[0026]1、步骤(3)中得到的水牛手工克隆转基因重构胚经5 ymol/L离子霉素处理5min，再用2mmol/L的6- 二甲氨基嘌呤培养3h以进行化学激活处理；
[0027]I1、经化学激活处理的重构胚在含有混合培养液的微穴中置于38.5°C,5% 0)2和100%湿度的培养箱中培养6-7天，获得发育到囊胚阶段的水牛转基因克隆胚胎，其中混合培养液是由RVCL液与SOF液以体积比1:1混合。
[0028]本发明具有以下有益效果:
[0029](I)、用本发明的方法，成功获得了手工克隆水牛转基因胚胎，转基因克隆胚胎的囊胚发育率达到33.3%。
[0030](2)、本发明的方法相比于显微操作核移植方法手工克隆无需昂贵仪器设配，简化了克隆的操作流程。
【附图说明】
:
[00