一种利用混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种制备丁酸的方法。
【背景技术】
[0002]丁酸是一种重要的化工原料，广泛用于化工产品、食品和药品等行业。从物理化学角度，丁酸较乙酸更适合作为生产生物燃料的中间产物，因为丁酸具有更长的碳链和更低的ο/c比，能够增加能量的密度。并且丁酸含量高的混合羧酸可以用来生产聚羟基丁酸酯(PHB)，其可以作为生物可降解塑料的原料。目前，丁酸的工业生产主要采用源于石油化工的正丁醛氧化法。与化学法相比，生物发酵法具有原料广泛、环境友好和可持续等优点。目前生物发酵产丁酸的研宄主要是以淀粉、糖蜜、乳清、马铃薯、纤维素水解物为原料。每年通过光合作用产生的生物质约200亿t，其中大部分为木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源。如果以木质纤维素为原料发酵生产丁酸，不仅可保证相关产业的良性可持续发展，同时也可大幅降低原料成本，提高市场竞争力。已有的利用木质纤维素生产丁酸的研宄中，一般是先利用纤维素酶将木质纤维素水解为葡萄糖、木糖等单糖，再利用微生物发酵产丁酸。而纤维素酶的高成本被认为是生物转化木质纤维素的最大障碍。筛选和利用可以直接降解木质纤维素的丁酸发酵菌群，则是攻克这一障碍的有效途径之一。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种中温条件下利用不明确混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法，避免传统方法中纤维素酶的大量使用，完成丁酸的中温混合菌群发酵制备过程，降低制备成本。
[0004]本发明的一种利用混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法，它是按照以下步骤进tx的:
[0005]一、采用富集自牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤和腐木的混合物为初始菌群，以PCS培养基为基础，以预处理稻草稻杆为原料，配制种子培养基和发酵培养基；
[0006]二、将初始菌群接种于种子培养基，静置进行厌氧培养；
[0007]三、将步骤二培养后的菌群接种于发酵培养基，在140rpm转速条件下进行厌氧发酵，制备丁酸；
[0008]四、将步骤三制备的丁酸接种到槽式搅拌反应器中，进行丁酸发酵；
[0009]其中，步骤二中厌氧培养条件为:混合菌群培养温度为35°C，培养时间为14d ;
[0010]步骤三中接种的种子发酵液的体积为10mL，厌氧培养条件为:培养温度为35°C，培养时间为7d ；
[0011]步骤四中发酵液的体积为发酵系统体积的5%，厌氧培养条件为:35°C培养，培养时间为7?15d。
[0012]本发明包含以下有益效果:
[0013]本发明所采用的混合菌群富集自牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤和腐木的混合物，以PCS培养基为基础，以预处理稻草秸杆为原料，其主要步骤如下:
[0014]A、将混合菌群接种于种子培养基，进行厌氧培养；
[0015]B、将步骤A培养的混合菌群接种于发酵培养基中进行厌氧液态发酵，制备丁酸；
[0016]本发明采用预处理秸杆为原料，大幅降低原料成本；利用菌群中的微生物产生纤维素酶，避免商业酶制剂带来的高昂成本；利用筛选的菌群，降低中间产物对纤维素酶活性的抑制。本发明使用农业废弃秸杆为原料进行丁酸的生物发酵制备，对资源的再生利用及无污染新资源的开发都具有重要意义。
【附图说明】
[0017]图1 丁酸发酵装置。
【具体实施方式】
[0018]【具体实施方式】一:本实施方式的一种利用混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法，它是按照以下步骤进行的:
[0019]—、采用富集自牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤和腐木的混合物为初始菌群，以PCS培养基为基础，以预处理稻草稻杆为原料，配制种子培养基和发酵培养基；
[0020]二、将初始菌群接种于种子培养基，静置进行厌氧培养；
[0021]三、将步骤二培养后的菌群接种于发酵培养基，在140rpm转速条件下进行厌氧发酵，制备丁酸；
[0022]四、将步骤三制备的丁酸接种到槽式搅拌反应器中，进行丁酸发酵；
[0023]其中，步骤二中厌氧培养条件为:混合菌群培养温度为35°C，培养时间为14d ;
[0024]步骤三中接种的种子发酵液的体积为10mL，厌氧培养条件为:培养温度为35°C，培养时间为7d ；
[0025]步骤四中发酵液的体积为发酵系统体积的5%，厌氧培养条件为:35°C培养，培养时间为7?15d。
[0026]本实施方式步骤一中所述的初始菌群筛选过程为:将采集的样品置于以水稻秸杆为碳源的富集培养基中进行富集培养，在富集培养基中添加一片滤纸条作为指示物，以滤纸条完全崩解为标准，进行连续传代培养5个月(淘汰源于沼气渣、水沟底泥、灌木丛土壤和腐叶的富集培养物，保留源于牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤、和腐木的富集培养物)，然后将第17代(即培养5个月)的牛粪、玉米地土壤和腐木富集培养物以及第20代(即培养5个月)的猪粪堆肥富集培养物等比例混合，然后以水稻秸杆为碳源的富集培养基作为传代培养的培养基进行传代培养3个月，即得初始菌群。这5个混合菌群的纤维素降解能力趋于稳定，并最终进入基于丁酸发酵能力的复筛。
[0027]对个筛选的初始菌群的液相发酵产物进行测试，其中，源于牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤和腐木组合的混合菌群丁酸产量最高，为6.0g/L同时丁酸比例也最高，为75.4%。
[0028]本实施方式所述的初始菌群包含:梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、拟杆菌属(Bacteroides)和颤螺旋菌属(Oscillospira)。
[0029]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤一中所述的初始菌群包含以下菌株:纤维素降解菌、半纤维素降解菌、丁酸发酵菌、乙酸发酵菌和其它产酸发酵菌；
[0030]其中，纤维素降解菌包括:化糖梭状芽胞杆菌(Clostridium saccharolyticum)、多糖所装芽抱杆菌(Clostridium polysaccharolyticum)、嗜糖假单胞菌(Pelomonassaccharophila)、纤维化纤维单胞菌(Cellulosimicrobium cellulans)和 Clostridiumphytofermentans ；
[0031]半纤维素降解菌包括:Bacteroidesgraminisolvens、Clostridiumxylanolyticum、和 Ruminobacillusxylanolyticum ；
[0032]氨基酸降解菌包括:Aminobacteriumcolombiense 和 Proteiniphilumacetatigenes ；
[0033]丁酸发酵菌包括:柔嫩梭菌(Clostridium Iepturn)和 Roseburia intestinali ；
[0034]乙酸发酵菌包括:Clostridiumhathewayi 和 Bacteroides oleiciplenus ；
[0035]其它产酸发酵菌包括:0scillibactervalericigenes、Clostridialesbacterium>Bacteroidetes bacterium 和 Sedimentibacter sp。其它与【具体实施方式】一相同。
[0036]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤一中的种子培养基是以PCS培养基为基础配置的种子培养基，以预处理稻草秸杆为原料，其配制方法为:在IL培养基中加入:10g预处理过的稻草、5g蛋白胨、Ig酵母粉、5g NaCl、2g CaCCVfP 0.5g半胱氨酸；通入氮气10分钟，以保持培养基厌氧状态，密封，115°C灭菌20分钟。其它与【具体实施方式】一相同。
[0037]【具体实施方式】四:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤一中的发酵培养基是为基础配置的种子培养基，以预处理稻草秸杆为原料，其配制方法为:在IL培养基中加入:20g预处理过的稻草、5g蛋白胨、Ig酵母粉、5g NaCl、2g CaCOjP 0.5g半胱氨酸；通入氮气10分钟，以保持培养基厌氧状态，密封，115°C灭菌20分钟。其它与【具体实施方式】一相同。
[0038]本
【发明内容】
不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个【具体实施方式】的组合同样也可以实现发明的目的。
[0039]通过以下实施例验证本发明的有益效果:
[0040]实施例1
[0041]1、配制种子培养基
[0042]种子液体培养基具体配制方法如下:
[0043]在IL培养基中加入:10g NaOH预处理过的稻草，5g蛋白胨，Ig酵母粉，5g NaCl,2gCaC03，0.5g半胱氨酸。通入氮气10分钟，以保持培养基厌氧状态。每150mL血清瓶中装10mL培养基，密封，115°C灭菌20分钟。培养基配制，接种，取样均在厌氧条件下进行。
[0044]2、配制发酵培养基
[0045]发酵培养基具体配制方法如下:
[0046]在IL培养基中加入:20g NaOH预处理过的稻草，5g蛋白胨，Ig酵母粉，5g NaCl,2gCaC03，0.5g半胱氨酸。通入氮气10分钟，以保持培养基厌氧状态。每500mL血清瓶中装200mL培养基，密封，115°C灭菌20分钟。培养基配制，接种，取样均在厌氧条件下进行。
[0047]3、发酵工艺
[0048](I)采用富集自牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤和腐木的混合物为初始菌群，以PCS培养基为基础，以预处理稻草稻杆为原料，配制种子培养基和发酵培养基；
[0049]其中，步骤一中所述的初始菌群筛选过程为:将采集的样品置于以水稻秸杆为碳源的富集培养基中进行富集培养，在富集培养基中添加一片滤纸条作为指示物，以滤纸条完全崩解为标准，进行连续传代培养5个月(淘汰源于沼气渣、水沟底泥、灌木丛土壤和腐叶的富集培养物，保留源于牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤、和腐木的富集培养物)，然后将第17代(即培养5个月)的牛粪、玉米地土壤和腐木富集培养物以及第