Hps等温扩增快速检测用引物、试剂盒和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及细菌检测领域，具体是一种册S等温扩增快速检测用引物、试剂盒和 检测方法。
【背景技术】
[0002] 副猪嗜血杆菌（化emo地ilus parasuis, HP巧细菌是一种无芽抱、无鞭毛、有英膜 的革兰氏阴性菌，现归类为己斯德氏菌科嗜血杆菌属，目前至少可分为15个血清型，其中， 1、5、10、12、13和14型为强毒力血清型，2、4、15型为中等毒力血清型，3、6、7、8、9和11型为 无毒力血清型，且各血清型之间交叉保护力弱，疫苗的免疫效果较差，从而加重了 HPS的流 行。在患病猪体内，致病性册S分布于全身各组织器官，且W血清4、5、13型细菌较为多见。 早在1910年，德国科学家Glasser首次报道了 HPS ;1922年，Schermer和Hirlich从发病 猪中首次分离到了 HPS ;1931年，Lewis和化ope将该菌命名为H. Influenzae suis，他们发 现该菌是在一次猪流感的研究中，当他们分离到该细菌时认为该菌的生长同时需要X及V 因子；1943年该菌又被Hjarre和Wramby命名为猪嗜血杆菌化aemo地ilussuis) ;1969年， 该菌被重新命名为副猪嗜血杆菌（化emo地ilusparasuis)该是因为Biberstein和White 发现该细菌的生长不需要X因子；1952年，Bakos等人首先报道了册S存在的血清型；直到 1992年，Kielstein P等人才对HPS进行了定型，并报道了册S的15种血清型，其所鉴定的 血清型也被称为"Kielstein-Ra卵-G油rielson (KRG)血清分型方法"。
[0003] 副猪嗜血杆菌病也称猪革拉泽氏病（Glasser 'S)是由HPS引起的一种W纤维素 性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为典型特征的传染病。猪革拉泽氏病在全球范围内已成 为影响养猪业的典型细菌性疾病之一，在世界各地的发病率极高，据相关报道该病的真实 发病率可能为实际确诊数的10倍之多。册S主要通过空气、猪与猪之间的接触及排泄物进 行传播，主要传染源为病猪和带菌猪。该病通常只感染猪，有较强的宿主特异性，一年四季 均可发生，但W昼夜温差相差较大的早春和深秋季节多发，特别是发生一些应激性因素如： 转群、长途运输时均能促使本病的发生。处于2周龄~4月龄该一阶段的猪感染该菌的机 率较大，特别是断奶前后和保育期的仔猪。副猪嗜血杆菌病还可W与病毒性疾病、免疫抑制 性疾病发生混合感染，该种情况的发生增加了猪群疫病的复杂性若不及时控制会带来不可 想象的损失。目前一些养猪业发达的国家如美国、日本、加拿大、德国、澳大利亚、丹麦、西班 牙等对副猪嗜血杆菌病高度重视并对它的流行病学进行了调查，其结果显示此病在临床发 病猪中的分离率高达20 %左右。
[0004] 在我国，由HPS引起猪的多发性浆膜炎、关节炎的报道屡见不鲜，目前已从我国部 分省市分离出该菌，该病给我国养猪业造成了巨大的经济损失，该细菌的检测在出入境和 食品安全检验中起着重要的作用。随着社会的不断发展，科学的不断进步，传统的检测方法 已不能满足人们的需求，建立快速、准确的检测方法才是成功防制该病的关键。
[0005] 目前进行细菌分类鉴定中常用的的祀基因是16S rRNA，它是细菌染色体上编码 rRNA相对应的DNA序列，具有高度的保守性，16S rRNA基因检测技术已成为病原菌检测和 鉴定的一种强有力工具。HPS的生化反应复杂，不同毒力的菌株会有不同结果；琼脂扩散试 验虽是目前最准确有效的方法，但此方法耗时较长；间接血凝试验与猪胸膜肺炎放线杆菌 阳性血清存在交叉反应；PCR检测方法虽然特异性强，但是需要昂贵的PCR扩增仪。因此，发 明一种可W同时鉴别检测动物HPS 15种不同血清型的检测方法对研究我国猪肉中WS感 染情况具有重要意义。国内外在病原体的检测方法，利用lamp方法对多种动物疫病和微生 物检测已有很多报告，但在兽医临床诊断方法，化emo地ilus parasuis诊断方法的报导并 不多且灵敏度不高。
[0006] 环介导等温扩增基因技术（loop-mediated isothermal amplication,简称LAMP) (国际专利公开号WO 00/28082)是2000年Notomi等开发出的一种核酸扩增新技术，针 对待测祀基因序列的8个区域设计一套S对特异引物，利用链置换DNA聚合酶炬St DNA polymerase)在65°C左右等温条件下能够特异性、高效、快速的进行核酸扩增，扩增结果可 直接对扩增副产物焦磯酸儀沉淀通过肉眼进行判断或检测其浊度，也可用结合双链的巧光 染料优选SYBR Green I染色，即可通过肉眼判定。由于LAMP技术扩增的3对引物是针对 祀基因的8个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时是等温条件下即不需要PCR仪等特 殊仪器，且样品的前处理非常简单、单位时间内扩增效率更高等优点，已引起人们的关注。
[0007] 中国发明专利（申请号为；200710030435. (K200710030437. X、200710132320. 2、 200710026389.7、200810052321. (K200810015001. 8、200810093986. 6、200910041358. 8、 200910251055. 9、200910090037. 7、201010555073. 9、201110339104. X 等）分别公开了采用 环介导等温扩增基因技术检测病菌和动物疫病的方法。但是，目前尚无利用环介导等温扩 增基因技术检测HPS的试剂盒。
【发明内容】
[000引为克服现有技术的不足，本发明将LAMP恒温扩增技术运用于HPS的快速检测，使 检测的特异性和灵敏度比普通变温PCR方法更高。本发明的第一个目的是提供一种册S等 温扩增技术快速检测用引物，第二个目的是提供使用该引物的试剂盒，第=个目的是提供 使用上述检测用引物的试剂盒的使用方法。
[0009] 为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：
[0010] HPS等温扩增快速检测用引物包括；DNA序列为SEQ ID NO. 1的副猪嗜血杆菌内引 物上游；DNA序列为SEQ ID NO. 2的副猪嗜血杆菌内引物下游；DNA序列为SEQ ID NO. 3的 副猪嗜血杆菌外引物上游；DM序列为SEQ ID NO. 4的副猪嗜血杆菌外引物下游；DM序列 为SEQ ID NO. 5的副猪嗜血杆菌环引物上游；DNA序列为SEQ ID NO. 6的副猪嗜血杆菌环 引物下游。
[0011] 应用W上引物本发明提供了一种册S等温扩增快速检测用试剂盒，包括扩增反应 液管、巧黄绿素显色剂管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中：
[0012] 所述扩增反应液管管内由W下反应液组成：
[001引 DNA序列为SEQ ID NO. 1的50mmol/L的HPS内引物上游1. 0 y L ;
[0014] DM 序列为 SEQ ID NO. 2 的 50mmol/L 的 HPS 内引物下游 1. 0 y L ;
[00巧]DNA序列为SEQ ID NO. 3的5mmol/L的HPS外引物上游1. 0 y L ;
[0016] DNA 序列为 SEQ ID NO. 4 的 5mmol/L 的 HPS 外引物下游 1. 0 y L ;
[0017] DM 序列为 SEQ ID NO. 5 的 30mmol/L 的 HPS 环引物上游 1. 0 y L ;
[001引 DM序列为SEQ ID NO. 6的30mmol/L的HPS环引物下游1. 0 y L ;
[0019] 2XLAMP buffer 12. 5yL ；
[0020] 5U/ y L Bst DM 聚合酶 0. 8 y L ;
[0021] 灭菌去离子水3. 7yL;
[0022] 合计23化，为单次反应的用量；
[002引所述阳性对照管，管内为HPS阳性重组质粒DNA，体积为20 y L。
[0024] 所述阴性对照管，管内为无册S感染的猪肉组织液基因组DM,体积为20 y L。
[0025] 所述巧黄绿素显色剂管，管内体积为20 y L ;
[0026] 所述灭菌去离子水管ImL~2mL。
[0027] 本发明还提供了一种利用上述试剂盒进行册S等温扩增快速检测的方法，包括如 下步骤：
[002引 （1)样品中核酸模板的提取：取200化~300化或200mg~300mg待检样品，可 选用相应的市售商品化核酸提取试剂盒或实验室常规使用的提取细菌核酸的方法提取样 品中的DNA，即为核酸模板；
[0029] (2) LAMP反应体系：取1 y L核酸模板或阳性对照或阴性对照，分别加入LAMP扩增 反应液23 y L巧黄绿素（Calcein)显色剂1 y L反应体系的总体积为25 y L ;
[0030] (3) LAMP扩增条件；将步骤（2)配制好的反应体系的PCR管于65 °C恒温反应 60min，80°C终止反应；
[0031] (4)结果判定；通过LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪进行实时观察；阳性 扩增在15min内可见明显的实时扩增曲线和浊度扩增曲线，阴性无任何扩增；或者，反应产 物显现黄绿色则为阳性，澄色则为阴性；或者，通过肉眼观察鉴定，与阴性对照管比较显示， 检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。
[0032] 本发明的原理是：针对一段185bp左右的祀序列上8个区域设计6条引物（2条外 引物、2条内引物和2条环引物），利用核酸分子在65°C左右的温度下处于自然松散状态， 采用具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下对目的基因进行高效扩增，经15~ 30min的反应，模板扩增效率能达到109~10 W倍。由于该反应不需要高温节链、退火等步 骤，因此不需要昂贵的PCR仪。在反应的Buffer反应液里加入一种特殊的发光剂巧黄绿素 显色剂，巧黄绿素显色剂本身是一种发绿光的巧光，在本反应中采用的巧黄绿素显色剂是 被铺离子整合处理过的，不能发黄绿色巧光，一旦LAMP反应发生，产生的大量焦磯酸根离 子可竞争性地结合铺离子，释放出巧黄绿素显色剂，导致反应呈黄绿色，通过黄绿色巧光的 产生也能判定反应结果。该种比较温和的温度条件W及没有温度循环使所需仪器简单化， 克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本等缺点、此外，该检测方法对检测 人员的技术素质要求较低，实际操作极为简单，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立 成本低廉的快速筛选体系。
[003引 LAMP是一种简便、快速、高度特异性的基因