ZmAGO1a蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种ZmAGOIa蛋白及其编码基因与应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] AGO蛋白作为RNA诱导沉默复合体的核心元件，在RNA沉默中发挥关键作用。原 核生物AGO蛋白是防御外源遗传元件入侵等防御系统中的关键组分，古细菌在RNAi系统 中具有相似的功能。真核生物AGO蛋白在基因表达调节发挥重要作用，广泛参与多种生 物学过程，包括发育时序、细胞分化、细胞增殖、细胞死亡、代谢控制、免疫及转座子沉默等 (WeiKF，etal.，2012，PumplinN，etal.，2013)，另外，AGO蛋白在转录、可变剪切，甚至 DNA修复等方面发挥重要作用（MeisterG，2013)。AGO是一种多结构域、较大的蛋白（约 90-100kDa)。真核生物AGO蛋白通常由N端结构域、PAZ结构域、MID结构域及PIWI结构域 四个基本的结构域组成（ToliaNH,etal.，2007)。Bohmert等在研宄拟南芥一系列agol突 变体时，由于其突变表型很像小乌贼，故将此类突变体命名为Argonaute蛋白，与其对应的 基因称为AG01(BohmertK，etal.，1998)。Yigit等（YigitE，etal.，2006)根据AGO蛋 白系统进化关系以及它们结合sRNA的能力，将来自植物、动物和真菌中代表物种的AGO蛋 白家族成员分为三类：Ago亚族、PIWI(P-elementinducedwimpytestis)亚族及WAG0亚族 (Worm-specificargonaute)。AGO亚族成员蛋白与拟南芥AtAGOl相似，其成员能够结合 miRNA和siRNA，指导RISC靶向合适的靶位点。PIWI亚族成员蛋白则与果蝇DmPIWI相似， PIWI亚族成员可以与piRNA(PIWI_interactingRNA)结合。WAG0成员仅存在于懦虫，能够 结合次生siRNA。
[0003]AG01主要参与miRNA靶向mRNAs的切割，还涉及转基因的转录后基因沉默（Schuck J，etal.，2013)和染色质结构的维持等。最初agol突变体表现器官极性缺陷，证明拟南 芥AG01参与miRNA路径（A.KC，etal.，2004)。在agol突变体中，miRNA积累下降，相反 miRNA靶基因积累增加，表明AG01对维持miRNA通路的完整性是必需的（VaucheretH，et al.，2004)。AG01还参与siRNA介导的PTGS防御反应，阻碍来自病毒和转基因的外源 RNA(MartinezdeAlbaAE,etal.,2011)〇
[0004] 小麦中报道了两种AG01 基因TaAG01a-lb(LiuT-l,2011,MengF,etal.,2013)， 对基因结构和表达特征等做了相关研宄，但仍缺少生物学证据。同样的在玉米上，玉米AG01 基因鉴定仍缺乏较系统的实验与分析证据，研宄仍集中在模式植物拟南芥和水稻中。钱叶 雄等利用生物信息学方法预测18个ZmAGO基因，其中ZmAGOl成员共五个，但在分子水平上 仍缺少证据。
[0005] 玉米是我国播种面积与总产量第一大作物。当前我国玉米年播种面积高达5. 3亿 亩。由于生产上广泛采用杂交种，种业上具有重大的开发价值，是我国粮食作物中种业商业 开发价值最大的作物。培育高产、耐逆与高效的玉米品种具有重要的生产与种业开发意义 与价值。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是培育高产、耐逆与高效的植物（如玉米）。
[0007] 为了解决以上技术问题，本发明提供一种蛋白，为如下⑴或（2)所示：
[0008] (l)SEQIDNo. 2 所示的蛋白；
[0009] (2)将SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。
[0010] 为了解决以上技术问题，本发明还提供了所述蛋白的编码基因。
[0011] 上述编码基因中，所述编码基因为如下中至少一种：
[0012] 1)SEQIDNo. 1 所示的DNA分子；
[0013] 2)SEQIDNo. 1中第150至第3458位所示的DNA分子或cDNA分子；
[0014] 3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子或cDNA分子杂交且编码所述蛋白质 的DNA分子或cDNA分子；
[0015] 4)与1)或2)或3)限定的DNA分子或cDNA分子具有90%以上的同一性且编码 所述蛋白质的DNA分子或cDNA分子。
[0016] 为了解决以上技术问题，本发明还提供了含有上述任一所述编码基因的重组载 体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
[0017] 为了解决以上技术问题，本发明还提供了一种促进植物生长和/或发育的方法， 包括如下步骤：将上述任一所述的编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植 物相比，转基因植物的生长和/或发育进程加快或生长和/或发育水平提高。
[0018] 上述方法中，所述生长和/或发育进程加快体现为开花期和/或成熟期提前；
[0019] 所述生长和/或发育水平提高体现为生物产量提高；
[0020] 所述生物产量提高具体体现为叶片数增加、叶长增长、叶宽增大、结荚数和/或种 子数提尚。
[0021] 上述任一所述的方法中，所述编码基因是通过重组表达载体导入的，所述重组表 达载体是将所述编码基因插入出发载体PCPB的多克隆位点得到的；
[0022] 所述重组表达载体具为将SEQIDNo. 1中第123至第3610位核苷酸所示的序列 插入pCPB的BamHI位点，pCPB的其余序列保持不变得到；
[0023] 所述植物具体为玉米或拟南芥；
[0024] 所述玉米或拟南芥具体为具有生长和/或发育缺陷的玉米或拟南芥；
[0025] 所述拟南芥具体为拟南芥ago1-27突变体。
[0026] 为了解决以上技术问题，本发明还提供了上述蛋白或上述任一所述的编码基因在 促进植物生长和/或发育中的应用；
[0027] 所述植物具体为玉米或拟南芥；
[0028] 所述玉米或拟南芥具体为具有生长和/或发育缺陷的玉米或拟南芥；
[0029] 所述拟南芥具体为拟南芥ago1-27突变体；
[0030] 所述促进植物生长和/或发育具体体现为植物的生长和/或发育进程加快或生长 和/或发育水平提高；
[0031] 所述生长和/或发育进程加快具体体现为开花期和/或成熟期提前；
[0032] 所述生长和/或发育水平提高具体体现为生物产量提高；
[0033] 所述生物产量提高具体体现为叶片数增加、叶长增长、叶宽增大、结荚数和/或种 子数提尚。
[0034] 本发明提供的ZmAGOla基因可显著影响植物的生长与发育：包括结实性、成熟期 (早熟）、开花期、叶片数、叶片大小、叶片形状、叶片颜色等等，这些性状大都属于重要的农 艺性状，与植物的产量、生育期与株型相关，在培育高产、耐逆与高效的植物（如玉米）中具 有重大应用价值。
【附图说明】
[0035] 图1为植物过表达载体pCPB-35S: :ZmAGOla结构示意图。
[0036] 图2为转基因拟南芥中Bar基因和ZmAGOla基因的检测。
[0037]图3为拟南芥agol-27突变株（agol-27)、野生型哥伦比亚生态型拟南芥（wt)、T3 代阳性拟南芥agol-27突变体转基因植株纯系（Iinel6、linel9和line21)的苗期、开花期 和成熟期形态。
[0038] 图4为转基因拟南芥中ZmAGOla基因和AtAGOl基因的实时荧光定量PCR检测。
[0039] 图5为玉米不同器官中ZmAGOla基因表达的组织特异性分析。
[0040] 图6为玉米幼叶中ZmAGOla基因在5种非生物逆境条件下的差异表达响应特征。
【具体实施方式】
[0041 ] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0042] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0043] 玉米自交系被 478(ZeamayssspL.)在文献"XieC.，ZhangS.，LiM.，Li X. ,HaoZ,BaiL,ZhangD.i,LiangY. (2007)Inferringgenomeancestryandestimating molecularrelatednessamong187Chinesemaizeinbredlines.J.Genet.&Genomics 34(8) :738-748"中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研宄所获得，该自交系为国 内玉米育种与生产上常用的亲本自交系。
[0044] pCPB质粒在文献"NanWu，PiwuWang，DanLi，LiqiangDai，Chengzhong Zheng,ShiLu，YuanCai，ZhuoZhang,JingQu,HaifengXiaYiChuan.Functionof chalconereductasegeneCHRlinsoybean. 2014 ;36(7):707_12?"中公开过，公众可从中 国农业科学院作物科学研究所获得。
[0045] 拟南芥agol-27 突变体在文献"MorelJB:FertileHypomorphic ARGONAUTE(agol)MutantsImpairedinPost-TranscriptionalGeneSilencingand VirusResistance.ThePlantCellOnline2002，14:629_639. " 中公开过，公众可从中国 农业科学院作物科学研究所获得，该突变体具有明显的发育缺陷，叶色呈深绿色，锯齿状叶 片，与哥伦比亚生态型拟南芥相比，开花延迟7到12天，结实率只有哥伦比亚生态型拟南芥 的45-60%，该突变株只有AtAGOl基因突变。
[0046] 哥伦比亚生态型拟南芥（A.thanlianaecoypeColombiaO,Col-0)在文献"Morel JB:FertileHypomorphicARGONAUTE(agol)MutantsImpairedinPost-Transcriptional GeneSilencingandVirusResistance.ThePlantCell0nline2002, 14:629-639?中公 开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
[0047] 玉米B73 自交系（ZeamayssspL.)在文献"XieC.，ZhangS.，LiM.，LiX.，Hao Z,BaiL,ZhangD.i,LiangY. (2007)Inferringgenomeancestryandestimating molecularrelatednessamong187Chinesemaizeinbredlines.J.Genet.&Genomics 34(8) : 738-748"中公开过，公众可从