一种亚健康康复用自体免疫细胞新技术的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明是将自体免疫细胞培养诱导用于亚健康康复，涉及基础医学、康复医学领 域。
【背景技术】
[0002] 当人类进入二十一世纪，生命质量的提高和生命时间的延长，人们对健康的需求 日益强烈，对疾病认识的水平也不断提高。医学的发展也从过去的疾病治疗策略转向生 物-心理-社会医学模式，当今医学的主题是预防疾病，特别是亚健康人群的保健。一项 WHO的调查显示：真正健康的人群仅占5 %，疾病者为20 %，而75 %的人群处于亚健康状况。 我国亚健康人群约为70%。何为亚健康，它是指是介于健康和疾病之间的一种生理功能低 下的状态，主要表现为出现明显身心不适现象但机体无结构和代谢的异常。亚健康状态是 没有明显临床症状的，也不能用相关临床诊断指标确诊，而疾病的发生往往都有个量变到 质变的发展过程，亚健康状态正是从健康向疾病发展的过渡阶段。常见"亚健康"状态表 现：浑身无力，容易疲倦，思想涣散，头痛，耳鸣，眼睛疲劳，鼻塞眩晕，咽喉异物感，手足发凉 麻木，便秘，颈肩僵硬，胃闷不适，睡眠不良，心悸气短，容易晕车，起立时眼前发黑，早晨起 床有不快感等。关于亚健康病因学说，当前比较流行的是免疫学说、自由基学说，同时与遗 传背景相关。亚健康的治疗目前常用的方法有传统疗法、心理疏导、运动疗法、营养疗法等， 这些疗法具有一定的效果，但不能很好地改善亚健康人群身体状况。
[0003] 免疫系统是人体最重要的组成部分，是人体健康的保护墙，由免疫器官（骨髓、胸 腺、脾脏、淋巴结、扁桃体、小肠集合淋巴结、阑尾、胸腺等）、免疫细胞（淋巴细胞、单核吞噬 细胞、中性粒细胞、嗜碱粒细胞、嗜酸粒细胞、肥大细胞、血小板等）和免疫分子（补体、免疫 球蛋白、干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子等）等组成，起着免疫防御、免疫自稳和免疫监 视的功能。免疫系统功能紊乱，尤其是免疫细胞的质和量的改变会对机体健康产生重大影 响。亚健康状态时，人体生理功能下降，免疫力低下，导致身体疾病症状加重和身体的社会 功能的缺陷，致使慢性疾病的调节机能削弱，进而引起躯体功能性或器质性病变。这种改变 正是免疫细胞发生了变化，如在消极情绪状态下淋巴细胞增殖减少，自然杀伤细胞活性降 低，血液循环中白细胞和抗体的数量改变，导致免疫功能减退。免疫系统是一个高度复杂的 系统，它与机体内部其它各系统、各脏器相辅相成，帮助我们抵御外部微生物的侵入。免疫 系统功能的低下将会导致：①免疫防御功能降低，各种来自外界的病毒、细菌入侵人体，导 致感冒和腹泻。②机体自身稳定破坏，协调系统内各细胞、器官之间的能力下降，导致身体 出现一些异常症状，如内分泌系统紊乱，在女性会出现月经失调而经前腹痛、烦躁易怒、面 色萎暗和肥胖等；神经系统紊乱就容易出现心悸、多梦、失眠等症状；同时会出现过敏如常 因花粉、尘埃、动物皮毛、药物、食物敏感而打喷嚏、流眼泪、脸部瘙痒、皮疹等免疫反应。③ 免疫细胞监视能力降低。亚健康状态时，人们常轻微发烧、咽喉痛、淋巴结肿大、注意力不易 集中、全身无力、体内荷尔蒙代谢失调。长久以后引起正常细胞的异常突变，由于机体清除 能力下降，使得这些细胞得以繁殖扩散而最终形成肿瘤。
[0004] 免疫细胞是免疫系统的主角，改善和提高免疫系统细胞的质和量是亚健康康复的 关键。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killers, CIK)，是将亚健康者外周 血淋巴细胞在体外与多种细胞因子共培养后所获得的一群异质性细胞。CIK细胞具有增殖 快速、杀伤能力强、具有广谱杀伤效应、对正常细胞无损伤作用、可调整人体的免疫状态、刺 激骨髓造血等重要作用，是目前已知活性最高的非特异性杀伤免疫效应细胞。树突状细胞 (dendritic cell, DC)是体内功能最强大的专职抗原递呈细胞，也是唯一能激活幼稚T细 胞的抗原递呈细胞，在免疫应答的诱导中具有独特地位。它最重要的作用是可摄取肿瘤抗 原，提呈给T淋巴细胞，诱导、激活、增殖细胞毒性T淋巴细胞（CTL)，从而介导强大的特异性 细胞免疫功能。同时DC细胞对机体还可以发挥非特异性免疫保护作用。DC细胞和CIK细 胞共培养（DCIK)可以相互促进对方的保护性细胞因子的产生，提高彼此的免疫功效。利用 亚健康者外周血免疫细胞经体外培养诱导产生的DCIK细胞回输，启动人体免疫机制，提高 人体免疫力，可使亚健康者提高生活质量，增强食欲、改善睡眠、增强体力，且安全无毒副作 用，是任何传统康复法所无法比拟的。通过体外体内法将自体免疫细胞回输可使亚健康者 恢复其原有的健康状况。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种亚健康康复新技术，它是获取亚健康者外周血，并在100 级GMP厂房分离单个核细胞，添加相关营养因子等诱导培养并经质检，合格的免疫细胞回 输给亚健康者本人，达到其康复的目的。这种自体免疫细胞康复无需配型，无需检测特定的 病毒，简单易行、安全可靠，并具有良好的康复效果。
【具体实施方式】
[0006] 通过本实施例来具体说明本发明一种亚健康康复用自体免疫细胞新技术，将亚健 康者外周血单个核细胞分离，并诱导培养用于亚健康自身康复。本发明操作步序如下：
[0007] (1)亚健康人群筛选，入选者年龄35-55岁成年男女，没有重大疾病，身体状况稳 定。参与者进行健康问卷、自评、问诊、一级检查和二级检查。评价结果符合亚健康标准即 疲劳（休息不能缓解的疲劳；往常从事的活动下降50% )加任意6项次要症状（①畏寒、 低热，②咽喉不适，③淋巴结肿大，④不能解释的全身无力感，⑤肌肉酸痛，⑥头痛，⑦日常 活动后疲劳感不能回复，⑧关节疼痛，⑨睡眠紊乱，⑩精神、神经症状；急性、亚急性出现） 和任意2条体征（①颈淋巴结肿大< 2cm，②低热，②咽喉炎），或者疲劳加任意8项次要症 状。自我评价（早上起床时发丝掉落，情绪抑郁，健忘，工作令人厌倦，有自闭症式的渴望， 工作效率明显下降，身体倦怠，工作情绪无法高涨，进餐少，盼望早点逃离办公室，对污染、 噪声非常敏感，比常人渴望清幽，不再热衷于朋友聚会，经常失眠，体重明显下降，易感冒， 性能力下降）大于等于50分。一般身体检查正常，二级检查包括免疫细胞分类（总T淋巴 细胞、总B淋巴细胞、辅助/诱导T细胞、抑制/杀伤T细胞、r / & T细胞、NK细胞、NK-T细 胞，总白细胞及分类，DC细胞，CIK细胞，调节性T细胞即Treg、髓源性抑制细胞即MDSCs)、 免疫细胞功能（T、B、NK免疫细胞增殖检测，超敏反应）、免疫分子（补体、免疫球蛋白、干扰 素、白细胞介素、肿瘤坏死因子）和SOD (superoxide dismutase，超氧化物歧化酶）检测有 三项以上阳性或者高于/低于正常值。根据这些结果制定康复方案，即自体免疫细胞康复 疗程及辅以心理疏导、饮食调整、生理（包括休息、锻炼等）调节、传统康复（中药、推拿按 摩、针灸艾灸等）。
[0008] (2)自体免疫细胞的采集。无菌条件下静脉抽取亚健康者外周血50毫升，肝素 (20U / mL)抗凝，混匀并填写样本信息表，在4°C无菌环境下运至100级G M P车间加工。
[0009] (3)自体免疫细胞在GMP车间培养诱导。①CIK细胞和DC细胞的诱导扩增。在百 级G M P车间条件下，采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，将分离得到的 单个核细胞（用毛细管插到云雾层，该层白色略带黄色）按照细胞浓度为5X10 5 / ml接种 于 PRMI1640 培养基，添加 1000u / ml of IFN-gama、100u / ml of IL-la、500u / ml of IL-2细胞因子、lOOu / ml青霉素、lOOu / ml链霉素，1%自体血清，置37°C、5%C02条件下 常规培养24小时。转移细胞培养上清液（粘附细胞供DC细胞诱导扩增所用）即非粘附性 细胞至另一经5ug / ml of anti-⑶3单抗包被的培养瓶，在37°C、5%C02条件下常规培养 7天，期间3-4天更换培养液并添加细胞因子及血清，此为CIK (cytokine induced killer, 细胞因子诱导的杀伤细胞）细胞。未转移的粘附细胞用PRMI1640培养基继续培养并添加 100u / ml 青霉素、100u / ml 链霉素、1000u / ml of GM-CSF、500u / ml of IL-4 及 2% 的自体血清等培养7天，期间更换一次培养液并添加相应因子和血清，此为DC (dendritic cells，树突状细胞）细胞。②DC和CIK细胞共培养及分子表达的检测：将培养7天的DC 和CIK细胞以1 :3比例混合，培养液为上述CIK细胞培养液，37°C、5 % C02条件下常规培 养7天，期间3-4天更换培养液并添加细胞因子及血清。检测粘附细胞DC细胞表达CD80、 ⑶40、MHC-DR、IL-12水平及非粘附细胞CIK表达⑶28、⑶40和⑶40L的表达水平。
[0010] (4)免疫细胞制剂的质量控制。细胞培养诱导完成或培养过程中进行各项指标的 检测，这些指标包括：
[0011] ①无菌检测。?细菌检测：参照药典2010版附录XII A无菌检测法或用BD公司 的血细菌培养瓶，取细胞培养上清液3-5ml于BD血细菌培养瓶，置于培养仪培养2周后观 察结果。另一种简易方法是将细胞培养上清液离心后取沉淀物涂片革兰氏染色镜检。结实 验结果应为阴性。?内毒素检测：参照药典2010版附录XII E细菌内毒素检查法，内毒素限 值的确定按照相关说明计算。?支原体检测：参照药典2010版附录XII B支原体检查法， 结果应为无支原体生长。
[0012] ②生物活性检测。效应细胞DCIK体外生物活性分析（以同源CIK细胞、DC细胞 作为对照），将诱导培养的DCIK细胞、CIK细胞和DC细胞分别加适量培养液（上述CIK细 胞培养液），计数调节细胞密度4X106个/ml，并经培养液倍比稀释后其密度各分别为： 4\106、2\106、1\10 6和0.5父106个/1111。靶细胞4549的准备：贴壁生长细胞用胰蛋白 酶消化液处理、离心后，取悬浮