一种禾谷镰刀菌低毒病毒FgHV2/JS16及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种禾谷镰刀菌低毒病毒FgHV2/JS16 及其应用。
【背景技术】
[0002] 禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum Schw.)是镰刀菌中重要的一个种，能引起田 间禾本科作物病害。如有小麦赤霉病。侵染麦粒或玉米后，生出白色絮状或绒状菌丝，后呈 白色至玫瑰色、白色至粉红色或白色至砖红色。有性态为Gibberella zeae Schw. petch属 半知菌亚门真菌。无性态属子囊菌亚门真菌。在培养基中白色气生菌丝茂密，基内菌丝分 泌红褐色色素。生活史包括有性世代和无性世代。有性世代产生子囊壳，梨形有口。棒状 子囊丛生与子囊壳，每个子囊里有八个子囊孢子，子囊孢子纺锤形，通常有三个隔膜。无性 世代产生分生孢子，呈镰刀状，通常有三到五个隔膜。
[0003] 禾谷镰刀菌的寄主范围广泛，可侵染谷类作物小麦、大麦和玉米（Bluhm et al. 2007)，并且可以分泌一些毒素物质--单端孢霉稀族毒素类（Trichothecenes)和霉菌 毒素雌激素（Oestrogenic mycotoxin)、玉米微菌毒素（Zearelanone)，含有一定水平毒素 的谷物被人畜使用后会引起明显的中毒症状，包括恶心、呕吐甚至流产等。近年来，不同地 区和不同品种上引起麦类赤霉病的优势种菌为禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum schw) 目前，禾谷镰刀菌引起的麦类赤霉病的防治主要以化学防治为主，多使用广谱性杀菌剂如 阿米西达、噻菌灵和多菌灵等。化学药剂对赤霉病的防治效果较差，难以挽回损失。在发病 严重的田块，会引起大量的减产。而大剂量频繁使用化学农药又会对自然环境包括土壤、地 下水等造成严重的污染。药物残留会随着食物链逐渐聚集到人体内。土壤和地下水的污染 会造成自然环境的不断恶化，影响人类的生存条件。第二种防治方法主要为农事管理。如 要轮作栽培，防止因连作引起病原菌的积累。进行土壤、栽培基质消毒；栽培时发现病株应 及时拔除并销毁，减少病菌的进一步扩散。还有掌握好植株栽培密度，加强通风透气，降低 湿度，控制好土壤或基质的含水量，宜选用排水良好的基质。这些措施能够一定程度的防治 赤霉病的大爆发及流行。
[0004] 防治病害比较有效的办法为培育抗病品种。但截至目前，还没有商品化的完 全抗病或完全免疫的小麦品种。小麦对赤霉病的抗性分为五类，分别为一型抗侵入、二 型抗扩展、三型抗毒素积累、四型籽粒抗侵染及五型耐病型五个类型〃 (Mesterhazy et al.，1995)。目前，单基因转化小麦培育转基因小麦品种在技术上已经能够实现（Dahleen et al. 2001)。将一些已经鉴定的抗赤霉病基因转入优良小麦品种中能够有效的提高对赤 霉病的抗性。小麦等寄主抗赤霉病基因鉴定数量有限限制了抗病品种的培育。已鉴定的抗 性基因包括葡聚糖酶和几丁质酶等降解酶以及一些甜蛋白和阻碍脱氧雪腐镰刀菌烯醇聚 集的蛋白（Anand et al.2003)〇
[0005] 真菌病毒存在于所有的主要类群真菌中。自1962年第一例真菌病毒被报道以后， 大量的真菌病毒被发现并研宄。但是真菌病毒的研宄还没有得到足够的重视，并且表现出 一定的滞后性。主要原因包括，第一，真菌病毒侵染不表现出明显的症状，因此不容易被人 所发掘和重视，而且大部分的真菌学家在接触到菌落异常的菌株时不会想到可能是由于真 菌病毒侵染导致的。第二，研宄真菌病毒的病毒学家比较少。当前的研宄热点主要集中在 能减弱寄主致病性的真菌病毒，探索这些病毒的复制机制、蛋白功能以及在农业真菌病害 生物防治上的应用。至今为止的真菌病毒系统中，仅栗疫菌低毒病毒CHV1/EP713被成功用 于生物防治，它在意大利发现及应用，拯救了因栗疫病危害而濒临绝灭的欧洲栗树林。现 阶段植物真菌病害的防治是一个难题，随着化学农药的大量施用，在病害防治的同时给环 境造成巨大的污染，包括土壤污染、食品污染、大气污染和水污染。真菌病毒作为一项生物 防治资源，将会为真菌病害的防治提供一个新的途径。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种在减弱禾谷镰刀菌致病性方面具有显著效 果的禾谷镰刀菌低毒病毒FgHV2/JS16。
[0007] 一种禾谷镰刀菌低毒病毒FgHV2/JS16,其全基因组序列如序列表中SEQ ID NO:l 所示。
[0008] 本发明所述的禾谷镰刀菌低毒病毒FgHV2/JS16在减弱禾谷镰刀菌致病性的应 用。
[0009] 一种菌株，其含有本发明所述的禾谷镰刀菌低毒病毒FgHV2/JS16。
[0010] 本发明所述的菌株，保藏号CGMCC NO. 10323,保藏日期：2015年1月20日。
[0011] 本发明禾谷镰刀菌低毒病毒FgHV2/JS16与现有技术不同之处在于：本发明所述 的禾谷镰刀菌JS16菌株是本实验室从江苏省发生赤霉病的小麦穗上分离的，已经于2015 年1月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)进行了保藏，登 记入册编号保藏号CGMCC NO. 10323。本实验室已成功从JS16菌株鉴定到低毒病毒科病毒 FgHV2/JS16,其可以减弱禾谷镰刀菌致病性的功能研宄，具有在生物防治中的应用潜能，并 具有广阔的应用前景。
[0012] 下面结合附图对本发明的禾谷镰刀菌低毒病毒FgHV2/JS16作进一步说明。
【附图说明】
[0013] 图1为本发明中禾谷镰刀菌菌株JS16中所提取的双链RNA ;泳道M，DNA marker ; 泳道1，菌株JS16分离到的dsRNA ;泳道2,菌株HN10提取dsRNA作为阳性对照；泳道2,菌 株JS16-F提取dsRNA作为阴性对照；
[0014] 图2为本发明中菌株JS16提取病毒FgHV2/JS16的基因组结构图，gRNA为病毒基 因组结构图，D-RNA为病毒所含有缺陷型RNA的结构图；
[0015] 图3为本发明中菌株JS16-F用Northern杂交证实脱毒情况；gRNA为病毒基因组 RNA，D-RNA为病毒的缺陷型RNA，Probl是地高辛标记的病毒基因组RNA 5'端cDNA探针， Prob2是地高辛标记的病毒基因组RNA 3'端cDNA探针，JS16是带毒菌株，JS16-F是脱毒 菌株；
[0016] 图4为本发明中菌株JS16和JS16-F在PDA培养基上的菌落形态JS16是带毒菌 株，JS16-F是脱毒菌株；
[0017] 图5为本发明中菌株JS16和JS16-F在PDA培养基上的菌落直径（A)、生长速度 (B)和在PDB培养基上生物量（C) JS16是带毒菌株，JS16-F是脱毒菌株；
[0018] 图6为本发明中菌株JS16和JS16-F的分生孢子产量比较。JS16是带毒菌株， JS16-F是脱毒菌株；
[0019] 图7为本发明中菌株JS16和JS16-F的DON毒素产量比较JS16是带毒菌株， JS16-F是脱毒菌株；
[0020] 图8为本发明中菌株JS16和JS16-F的致病性比较，A是每麦穗发病小穗数统计， B是麦穗发病情况，C是发病小穗的籽粒品质情况；JS16是带毒菌株，JS16-F是脱毒菌株。
【具体实施方式】
[0021] 实施例1禾谷镰刀菌JS16菌株病毒dsRNA提取
[0022] 先将甘油管中冻存的镰刀菌菌株进行活化。挑取已活化菌株的菌饼，放置于覆盖 有一层玻璃纸的PDA培养基上平板的中央位置，25°C培养96h。病毒基因组提取方法参照 植物病毒dsRNA提取的方法。RNA提取的过程中尽量使用一次性塑料器皿，若用器皿如研 磨棒、玻璃器皿等应在使用前按下列方法进行处理看，用〇. 1% DEPC(焦碳酸二乙酯）水溶 液在37°C下处理12小时，然后在120°C下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。实验操 作的主要步骤如下：①将菌丝已长满整个PDA平板的玻璃纸揭下，轻轻卷曲后放入2ml离 心管内，用研磨棒液氮研磨均匀，加入2倍体积（w/v)的1XSTE缓冲液、2倍体积的（v/v) Tris饱和苯酚和2%的10% SDS，室温搅拌lh ;②10,000rpm离心20min后取上清，加入 等体积的氯仿，室温搅拌l〇min ;③12, OOOrpm离心10min后取上清，加入乙醇至终浓度为 16% (v/v)，再加入 4%的 CF-11 纤维素（w/v)。室温搅拌 30min;④ 12,000，印111离心3111；[11 倒掉上清留沉淀，加入含16%乙醇的IX STE缓冲液，剧烈震荡lmin，沉淀用含16%乙醇的 1 X STE缓冲液重复洗涤三次；⑤12, 000, rpm离心3min留沉淀，加入1 X STE缓冲液，剧烈 震荡lmin，12, 000, rpm离心3min，将上清转移到另一离心管内，沉淀用1 X STE缓冲液重复 溶解一次。合并两次所得的洗脱液；⑥加入1/10体积的NaAc (3mol/L，pH 5. 2)，再加入2. 5 倍体积的无水乙醇，混匀后，置于_80°C冰箱lh ;⑦4°C，12, OOOrpm离心15min，弃上清留沉 淀，用70冷乙醇洗涤两次，吹干后溶于30ul的DEPC处理的ddH20 ;⑧DNA酶消化。加入lul RNase-Free 的 DNase I 和 3. 44ul 的 lOXDNase I buffer 后，37°C消化 30min ;⑨ 1%琼脂 糖凝胶电泳。
[0023] 结果：带毒菌株JS16及其所携带的dsRNA病毒经DNase消化后的1 %琼脂糖凝胶 电泳如图1所不，病毒含有2条dsRNA，一条大于10kb，一条大小5kb左右。
[0024] 本发明带毒菌株JS16已经于2015年1月20日在中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心（CGMCC)进行了保藏，登记入册编号保藏号CGMCC NO. 10323。
[0025] 实施例2禾谷镰刀菌低毒病毒FgHV2/JS16基因组的cDNA克隆及序列分析
[0026] (1)菌株JS16病毒基因组随机引物cDNA克隆
[0027] 随机引物反转录：模板为提取菌株JS16的dsRNA，反转录酶为promega的M-MLV， 所用引物为 Random Primer (26-mer) (5' -GACGTCCAGATCGCGAAITCNNNNNN-3'）。
[0028] PCR扩增：取上一步合成的cDNA产物为模板，利用单引物进行扩增，扩增引物为 Random Primer (20-mer) (5'-GACGTCCAGATCGCGAAITC-3'）。扩增所用的酶为全式金公司的 2XTrans