小麦microRNA408及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，尤其涉及小麦micr〇RNA408及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] microRNA(简称miRNA)是一类内源、非编码的小分子RNA，通过对靶基因mRNA 的降解或翻译的抑制来调控遗传信息的传递（Carrington and Ambros, 2003)。据统 计，约有1%的miRNA存在于真核生物的基因组中，负责调控约10-30%的基因（Cui et al.，2006)。在植物中，研宄发现miRNA基因常位于编码基因之间，通过靶基因mRNA来调节 植物生长发育、激素响应、生长时期转换、抗逆抗病等，对植物生长发育具有重要的调控作 用（Rubio-Somoza et al.，2011)，例如：叶和花的发育（Kidner et al.，2010)、花器官的形 成（Chen et al.，2004)、生殖细胞代谢（Allen et al.，2005)、茎端分生组织的发育（Hao et al.，2011)等。同时，miRNA能够响应外界胁迫（Kruszka et al.，2012)，包括干旱胁迫 (Zeng et al.，2010)、温度胁迫（Barakat et al.，2012)、盐胁迫（Frazier et al.，2011)、 氧化胁迫（Sunkar et al.，2006)和紫外胁迫（Wei et al.，2009)等，调节植物体内的miRNA 种类和数量随环境的变化而发生变化（周婧，2010)。
[0003] miR408是一段21个核苷酸组成的miRNA分子（王波，2006)，是植物中高度保守的 32个miRNAs之一（李培旺，2007 ;魏强，2013)。目前，已在33个物种中发现miR408基因， 包括拟南芥、水稻、白杨属、苜蓿物种中各1个，松柏类的1个物种，苔藓类2个物种（魏强， 2013)，另外还包括其他一些不常见物种。有报道表明，5个保守的miRNAs :miR159、miR164、 miR167、miR171和miR444在植物的激素信号调节中起作用（Reinhart et al.，2002;Guo et al.，2005)，miR159a通过MYB转录因子作用于GA和ABA信号系统（Achard et al.，2004 ; Schwab et al.，2005)，miR164a和miR167a则分别通过转录ARFs和NAC来控制生长素信 号系统（Rhoades et al.，2002) ;miR171和miR444控制的则是花的形态和发育，其作用机 制是分别调控转录因子SCL和MADS box (Rhoades et al.，2002 ;Lang et al.，2011 ;Zhang et al.，2006)〇
[0004]关于miR408靶基因的功能认知基本是一致的。miR408保守的靶基因是铜离子结 合蛋白（马圣运，2012)、Laccase(Abdel_Ghany and Pilon, 2008)和plantacyanins (Weigel et al.，2003 ;Abdel_Ghany and Pilon, 2008 ;Trindade et al.，2010)。第一类：铜离子 结合蛋白在拟南芥、苜蓿、水稻和白杨属中均已得到证实，主要是维持植物体内铜的稳态； 第二类：目前在拟南芥中发现的基因较多，如LAC3, LAC12和LAC13,除了维持铜的稳态外， 还可以参与干旱胁迫和植物细胞壁的生物合成；第三类：质体蓝素家族的一种蓝铜结合蛋 白，主要是参与植物的生殖发育。在拟南芥中，预测到miR408的靶基因是铜类蛋白的转录 因子plantacyanins和laccases，确认LAC3，LAC12和LAC13是革巴基因（Abdel-Ghany and Pilon, 2008)〇
[0005]在小麦miRNA的研宄中，高通量测序是一种高效快速的方法。2013年，Meng等人 对小麦谷粒中的miRNA进行了研宄，发现了605个保守的miRNA以及268个新的miRNA。其 中104个miRNA参与对谷粒饱满度的调控，miRNA在调控谷粒的产量以及面粉的质量上发 挥了极为重要的作用（Meng et al.，2013)。Bharati等人在小麦miRNA研宄中，得到4677 个miRNA，分别属于50个miRNA家族，其中有5个响应非生物胁迫的miRNA被发现，分别是： Ta-miR5653, Ta-miR855, Ta-miR819k，Ta-miR3708和Ta-miR5156。其中有四个先前就被预 测得到的四个砧1?隱：131111?1122，11111?1117，131111?1134 311(1131111?1133也被预测到，它 们的靶基因是参与泛素转运的蛋白（Pandey et al.，2013)。
【发明内容】
[0006]本发明的一个目的是提供一种microRNA。
[0007]本发明提供的microRNA，其为microRNA408,是如下1)或2):
[0008] 1)序列表中序列2所示的RNA;
[0009] 2)将序列表中序列2所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失 和/或添加且与植物开花相关的由序列2衍生的RNA。
[0010] 上述一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个核苷酸的取 代和/或缺失和/或添加。
[0011] 编码上述microRNA的DNA分子也是本发明保护的范围。
[0012] 上述DNA分子是如下1)-3)中任一种的DNA分子：
[0013] 1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；
[0014] 2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码与植物开花相关RNA的DNA分 子；
[0015] 3)与1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少 具有99%同源性且编码与植物开花时间相关RNA的DNA分子。
[0016] 上述严格条件可为在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0? 1 % SDS和1 X SSC，0? 1 % SDS各洗膜一次。
[0017]含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护 的范围。
[0018]转基因细胞不包括植物繁殖材料。
[0019]上述重组载体为将上述DNA分子插入表达载体中，得到表达上述microRNA的重组 载体。
[0020]在本发明的实施例中，表达载体为pZP211: :UBI。
[0021]上述重组载体为将序列表中序列1所示的核苷酸替换pZP211: :UBI载体的BamH I与Kpn I酶切识别位点间的DNA片段得到的质粒，命名为pZP211 UBI: :TamiR408,为表 达miR408的重组载体。
[0022]扩增上述DNA分子全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。
[0023]上述引物对具体为如下：
[0024]上游引物（TaMIR408-F) :5' -CTGGATCCGAGAGAAAGAGAGTTGATTTTGTGAG-3r(序列 3)；
[0025]下游引物（TaMIR408-R) :5' -TTGGTACCCTATAACAGGGGCAGAAAATGG-3r(序列4)。
[0026]上述microRNA、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在 调节植物开花时间和/或改变植物株型中的应用也是本发明保护的范围；
[0027]所述调节植物开花时间具体体现在抽穗时间提前和/或提高FT基因表达量；
[0028]所述改变植物株型具体体现在增加旗叶夹角、增加株高、增加节间距和/或提高 叶绿素含量；
[0029]所述植物为双子叶植物或单子叶植物，所述单子叶植物具体为小麦。
[0030] 本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
[0031] 本发明提供的方法，为将编码上述microRNA408的DNA分子导入目的植物，获得转 基因植物，
[0032]所述转基因植物具有如下特征：
[0033] 1)所述转基因植物的抽穗时间早于所述目的植物；
[0034] 2)所述转基因植物的FT基因表达量大于所述目的植物；
[0035] 3)所述转基因植物的旗叶夹角大于所述目的植物；
[0036] 4)所述转基因植物的株高大于所述目的植物；
[0037]5)所述转基因植物的节间距大于所述目的植物；
[0038]6)所述转基因植物的叶绿素含量大于所述目的植物。
[0039]上述方法中，所述编码上述microRNA的DNA分子通过上述的重组载体导入目的植 物。
[0040]所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为小麦。
[0041]本发明的实验证明，本发明通过克隆TamiR408基因，该基因为miRNA前体，用包含 TamiR408基因全长片段的DNA序列构建过表达载体，并导入农杆菌菌株，利用农杆菌介导 法侵染小麦幼胚，建立了转基因小麦株系。将转基因小麦株系进一步培育后与野生型植株 进行比较，发现利用该基因所得的转基因农作物具有抽穗时间提前、株型改变等表型。本发 明要解决的技术问题是在小麦中过表达TamiR408基因，改良小麦成熟期和株型等农艺性