与白菜黄色种皮基因Brsc-ye连锁的SSR分子标记引物及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于蔬菜育种及分子遗传学领域，具体涉及与白菜黄色种皮基因Brsc-ye 连锁的SSR分子标记引物的开发及应用。
【背景技术】
[0002] 白菜（BrassicarapaL.)属十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种，是起源于我国的主 要蔬菜作物之一，也是世界三大油菜之一，与人们的日常生活密切相关，近年来，随着人们 生活水平的提高，人们对油料品质的要求日益高涨。因此，黄色种皮白菜育种受到越来越多 国内外学者，育种家的重视。
[0003] 研宄表明黄色种皮的油菜籽种皮薄，所以含油量高，不仅如此，黄色种皮油菜籽生 产的油粗纤维含量较低，蛋白质含量较高，受到国内外的广泛关注。但是，白菜种皮颜色需 要开花结实且种子成熟后才能表现出，而且需要在田间逐株观察，操作起来费时费力，极大 的延缓了育种进程。因此为了加快黄籽白菜的育种速度，利用现代的分子生物技术，进行分 子标记辅助育种十分必要。
[0004] 随着分子生物学技术的快速发展，多种基于DNA多态性的分子技术应运而生，并 广泛应用于遗传育种研宄的各个领域。简单序列重复（simplesequencerepeats，SSR)，又 称为微卫星DNA(microsate11ite，DNA)，是一类由1-6个核苷酸串联重复组成的DNA序列如 (CA)n，（ATG)n，（TAGG)n等重复，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置，由于重复 次数的不同和重复程度的不完全造成了每个位点的多态性，包括SSR标记和EST-SSR标记 两种类型。其中，SSR标记具有共显性、重复性好、多态性丰富、易于检测等优点，已广泛应用 于植物遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研宄领域（Tautz andSchl6tterer，1994;Powelletal.，1996)0
[0005] 因此，基于以上SSR标记的优点，申请人利用白菜的测序结果，开发并成功筛选出 与白菜种皮颜色基因Brsc-ye紧密连锁的分子标记，并构建了Brsc-ye基因的分子遗传图 谱，为克隆该基因及利用该分子标记进行黄籽油菜、白菜分子辅助育种，加快育种进程奠定 了基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于，提供一种与白菜种皮颜色基因Brsc-ye紧密连锁的SSR分子 标记引物，应用该SSR分子标记引物，通过PCR方法，在苗期即可鉴定区分黄籽白菜和棕籽 白采，从而淘汰非目标植株，大大提尚选择的效率。
[0007] 为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：
[0008] 与白菜种皮颜色基因Brsc-ye连锁的SSR分子标记引物，包括已鉴定出的7对SSR 引物对中的一对，即可将黄色种皮与棕色种皮白菜区分开，同时使用两个标记能提高选择 的准确性。7对SSR引物对的脱氧核糖核苷酸引物序列如下：
[0009]引物对SSR309:
[0010]上游引物（F):5 ' -ACACTTTCTTCCTCCTCCCTCTCT- 3 ';
[0011]下游引物（R) :5 ' -CTCTCAACACTCCTCTCGHTTCC- 3 ';
[0012] 引物对SSR328:
[0013] 上游引物（F):5 ' -GAAGCCTGTTTGAACATTAC- 3 ';
[0014] 下游引物（R) :5 ^ -ATCTCCATTAGTTACTACGC- 3 ';
[0015]引物对SSR282:
[0016] 上游引物（F):5 ' -ATAACAACACTAGGCGACAG- 3 '
[0017] 下游引物（R) :5 ' -CTCTGCTAACACTTCCCTCT- 3 '
[0018]引物对SSR289:
[0019] 上游引物（F):5 ' -GCTGGTTAGGTGGTGTTGGT- 3 '
[0020] 下游引物（R) :5 ' -GTGGTGCITTGTCTTCGTCA- 3 '
[0021] 引物对SSR298:
[0022] 上游引物（F):5 ' -GCTCCAGGTGTTACCATATT- 3 '
[0023] 下游引物（R) :5 ' -TATCACCCAAAGCAAAGGAC- 3 '
[0024]引物对SSR340:
[0025] 上游引物（F):5 ' -AACCTAATTTCGTGTTCATG- 3 '
[0026] 下游引物（R) :5 ' -AAAGACAGTACGCACAGACA- 3 '
[0027]引物对SSR344:
[0028] 上游引物（F):5 ' -TGTTGTGGTTCTGAAATGGA- 3 '
[0029] 下游引物（R) :5 ' -TGAAGATGGTGAATGAAGCC- 3 '
[0030] 采用上述与白菜黄色种皮基因Brsc-ye紧密连锁的SSR分子标记引物，通过DNA 扩增，在苗期即可鉴定区分黄色种皮和棕色种皮白菜，从而淘汰非目标植株，大大提高选择 的效率。同时白菜黄色种皮基因Brsc-ye分子遗传图谱的构建可加快克隆该基因。
[0031] 所述的白菜黄色性状辅助选择的方法是：PCR扩增黄籽白菜基因组DNA的多态性 片段，引物SSR309和SSR328分别产生大小约为252bp和109bp的产物，这两个SSR标记分 别位于Brsc-ye的两侧，与Brsc-ye的遗传距离分别为0. 17cM和0. 29cM。
[0032] 本发明首次获得了与白菜黄色种皮基因Brsc-ye最为紧密连锁的分子标记引物， 具有检测方便，扩增稳定，重复性和准确率高等优点。其具体有益效果表现在：
[0033] (1)获得了在第6连锁群（A06)上白菜黄色种皮基因Brsc-ye的分子遗传图谱， 且首次获得与Brsc-ye基因紧密连锁的分子标记SSR309和SSR328,可在黄籽白菜分子标记 辅助育种及Brsc-ye基因克隆中发挥重要的作用。
[0034] (2)获得了与Brsc-ye紧密连锁的分子标记，并构建了其高密度遗传图谱。其中 SSR328与Brsc-ye连锁紧密，其遗传距离为0. 29cM，SSR309与Brsc-ye连锁最为紧密，其 遗传距离为〇. 17cM，这两个标记能够帮助该基因向推广品种中转移以及与其他抗病、抗逆 基因的聚合。
[0035] (3)鉴定方便。这2个标记均为共显性标记，具有扩增稳定、检测方便、快速等优 点。用这2个分子标记检测Brsc-ye基因，可以确定Brsc-ye的存在与否及存在的状态，进 而快速筛选携有Brsc-ye基因的植株，并用于黄籽白菜品种的选育。同时利用分子标记进 行检测时还可以避免环境对品种的影响，提高选择的准确性。
[0036] (4)提高黄籽白菜的选择效率。在传统的黄籽白菜鉴定过程中，必须等到白菜开花 结实且种子成熟后才能对种皮颜色性状进行观察统计，因此黄籽白菜的选育不仅费时，而 且难度大，成本高。用本发明的分子标记引物，通过检查与白菜黄色种皮基因Brsc-ye紧密 连锁的分子标记，可将表型鉴定的工作大大减少，在苗期即可区分黄籽和棕籽白菜，从而淘 汰非目标植株，因此，利用本发明的与Brsc-ye基因紧密连锁的分子标记，不仅节约成本， 而且大大的提高了育种效率，加快了育种进程。
[0037] (5)可用于克隆白菜黄籽基因的研宄。图位克隆白菜黄籽基因Brsc-ye的前提在 于获得与Brsc-ye紧密连锁的分子标记。SSR309和SSR328在所有已知的分子标记中与 Brsc-ye连锁最为紧密，为克隆该基因提供基础。
【附图说明】
[0038] 图1是白菜黄籽基因Brsc-ye的遗传连锁图，右侧为遗传连锁图的标记，左侧数据 为标记间的遗传距离（cM)。
[0039] 图2是SSR309在黄籽和棕籽亲本及匕代单株中的扩增结果；泳道信息：（从左到 右）M，50bpDNAladder;BP是棕籽亲本；YP是黄籽亲本，7个纯合棕籽单株；7个杂合棕籽 单株；7个纯合黄籽单株。
[0040] 图3 (a)棕籽材料92S105和（b)黄籽材料09Q5的种子。
[0041] 以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
【具体实施方式】
[0042] 以下实施例中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。
[0043] 本发明的与白菜黄籽基因Brsc-ye紧密连锁的SSR分子标记引物是通过以下步骤 获得的：
[0044] (1)群体材料准备
[0045] 以棕籽白菜"92S105"（西北农林科技大学学报（自然科学版）2011 (3) 11: 146-151)为母本，黄籽白菜"09Q5"（秦白6号大白菜的亲本之一，陕西农业科学，1999(3)， 5-6)为父本杂交产生的F1群体，然后通过单株自交获得其F2群体。
[0046] (2)白菜单株基因组总DNA的提取
[0047]A、取0. 2g去掉主脉的新鲜嫩叶片，塞入装有钢珠（钢珠需要由质量分数为75%的 酒精清洗过）的2mL的离心管中，放入液氮中速冻，利用组织研磨仪磨成粉末；
[0048] B、向离心管中加700 y 1经65°C预热的CTAB提取液（CTAB :2%，Tris-HCl (pH = 8.0) :100mmol/L，EDTA:20mmol/L，NaCl :1.4mol/L)，再加入10uL的0-疏基乙醇，迅速混 匀；
[0049]C、随后将离心管放入65°C烘箱中，中间每间隔5-10min分钟摇一次，温浴45min;
[0050]D、取出离心管，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1)的混合物，摇匀15min 后，常温下l〇〇〇〇r/min离心lOmin;
[0051]E、将上层液相（约700y1)转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿和异戊醇混 合溶液（氯仿：异戊醇=24 :1)，轻轻摇勾10min，常温下10000r/min离心10min;
[0052]F、取上清（约500yl)，加入2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱 团，-20°C条件下沉淀30min，4°C条件下8000r/min离心5min;
[0053]G、弃上清，加入500y1质量百分数为75%的乙醇洗涤沉淀2次后，沉淀物室温晾 干；
[0054]H、加入500y1的无菌蒸馏水溶解DNA，加入0? 29y1的RNaseA(10yg/y1)，混 匀后稍离心，37°C保温30min;
[0055]I、加入3mol/L的NaAc溶液50yL和2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA 抱团，-20°C条件下沉淀30min;
[0056] ]\在4<€条件下，800〇1'/111；[11离心5111；[11，弃上清，加入质量百分数为75%的乙醇清 洗沉淀1~2次后，沉淀物室温晾干，加入400y1~500y1的灭菌ddH20溶解使用，或加 入质量百分数为75%的乙醇-20°C保存备用；
[0057] (3)SSR序列的获得
[0058] 根据http://brassicadb.org/brad/index中公布的已知引物，共选取白菜10对 染色体上已知的引物120对，利用亲本材料对120对引物进行筛选，共筛选出30对差异引 物，然后随机选择棕籽材料和黄籽材料各7株，对这30对引物进行再次筛选，发现1对差异 引物A67,随后继续选取A67引物两侧已知引物，发现了另一对差异引物A0611。进一步沿 A0611到Brsc-ye方向设计SSR引物。利用SSRHunter软件对该区间序列内的SSR位点进 行检索，检索标准为：含二、三、四、五和六核苷酸类型的SSR基序（motif)的最小重复数分 别为5,4,3,3和3次。将检索得到的含SSR位点的序列在芸薹属基因组网站（http://www. brassica.bbsrc.ac.uk/)进行同源性比对，SSR序列选取条件为比对相似性85%以上，同 时有3条以上的同源序列与该序列存在SSR位点差异。
[0059] (4)SSR分子标记引物设计
[0060] 根据SSR差异位点两端的序列，采用Primer5. 0软件对符合条件的目标序列设计 引物。设计引物参数原则：退火温度为50°C~70°C，最佳温度为57°C;引物长度18bp~ 24bp;产物大小为100bp~300bp;引物（G+C)含量为40%~60%，引物不出现二级结构、 发夹结构和二聚体。引物由生工生物