气单胞菌溶素纳米孔通道的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子检测和DNA测序技术领域，具体的是气单胞菌溶素(aerolysin)纳米孔通道的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002]生物纳米通道是利用跨膜通道最为天然的纳米器件，其孔径一般仅为I?10纳米，只能容纳一个分子(如DNA、Micro-RNA、多肽、糖等)穿过孔道，因此，能够在水溶液体系实现对单个分子的实时、高通量、无标记超灵敏分析。目前，应用较多的生物纳米通道为α -溶血素、MspA纳米通道和SPl纳米通道。这些纳米通道能够实现对待测分子的超灵敏分析。然而，它们对于分子间微小的差别，如单个不同种类碱基的区分、不同Micro-RNA种类的区分以及DNA损伤的测试仍存在不足:分子穿过纳米孔道的速度过快、分辨率不够等。
[0003]为进一步提高纳米通道的分辨率，现有很多研究都在致力于对α -溶血素纳米通道进行修饰，以缩短纳米孔的有效孔径。例如，Bayley研究小组利用基因工程，定点突变α -溶血素孔道内部的氨基酸，嵌入环糊精以达到缩小孔径的目的，最终实现对分子微小变化的超灵敏检测。但是，这一技术的实现需要掌握基因突变技术，工作量大且不容易重复再现。此外，另一些研究致力于通过改变电解质溶液的浓度、引入DNA聚合酶、基因突变等方式使纳米通道内部带正电荷来降低DNA分子穿过纳米孔的速度。2008年，人们发现了孔径为1.2nm的MspA纳米通道，由于其孔径相对α -溶血素缩短了 0.2纳米，使对DNA检测的分辨率能力有了显著的提高。但是，由于野生型MspA通道内氨基酸带负电，若不经修饰得到的孔有相当多的背景信号，根本不能用于实验，因此，MspA用作纳米通道分析必须先经过基因突变的方法，将其孔道内部的负电荷转变为正电荷。这无疑增加了实验的难度，使得实验的过程更为复杂和困难。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于解决上述问题，提供一种气单胞菌溶素纳米孔通道的制备方法，它能在水溶液中自组装形成七聚体结构并经过构象变化插入磷脂膜中，形成纳米尺寸的通道，这种天然结构的纳米通道具有更小的孔径，更好的分辨率，在气单胞菌溶素纳米通道内腔表现出正电性，能与带负电的分子相互作用减慢待测分子的过孔速度，因此能够在单分子水平上分辨更为细微的变化，实现对单个碱基的超灵敏分辨；本发明的第二目的是，提供所述气单胞菌溶素纳米孔通道在DNA测序、DNA损伤、Micro- RNA检测中的具体应用。
[0005]为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案。
[0006]气单胞菌溶素纳米孔通道的制备方法，其特征是，包括以下步骤:
(1)气单胞菌溶素的前处理将trypsin-EDTA溶液和气单胞菌溶素以1:100混合并在室温下培养lOmin，活化后的气单胞菌溶素用PBS缓冲液配置并在_20°C冰箱中存储，储存浓度范围为0.1?10mg/ml ；
(2)用提拉法制备磷脂双分子层用聚缩醛树脂检测池作为载体制备磷脂双分子层，所述聚缩醛树脂检测池含有检测池I (即顺室)和检测池II (也即反室)，所述检测池II嵌入所述检测池I中；在磷脂双分子层形成后将所述聚缩醛树脂检测池分为两个区域:由于所述气单胞菌溶素纳米孔插入磷脂膜时是单向的，因此，定义气单胞菌溶素纳米孔嵌入磷脂膜后与大口端对应的是检测池I，与小口端对应的为检测池II ;在所述检测池II上有直径为50 μ m的小孔，用于形成磷脂双分子层；在检测池I的侧边有与池体连通的提拉孔，用于插入注射器对内部溶液进行提拉；将形成磷脂双分子层膜所用的1，2_ 二植烷酰基磷脂储存在氯仿溶液中，保存在_20°C冰箱中；具体过程为:
①配置磷脂正癸烷溶液，制备磷脂双分子层膜前须先将I，2-二植烷酰基磷脂氯仿溶液中的氯仿抽去，然后将90μ I正癸烷加入抽好的1，2_ 二植烷酰基磷脂中配置成磷脂正癸烷溶液；
②涂抹磷脂正癸烷溶液，用貂毛画笔在ImL检测池2的小孔内外两侧均匀涂抹磷脂正癸烧溶液并用N2吹干；
③施加电压，将检测池I和检测池II组装后分别加入ImL电解质溶液，将一对Ag/AgCl电极浸入电解质溶液中，通过电流放大器探头向磷脂双分子层膜两端施加10mV电压并指定顺室为虚拟接地立而；
④反复提拉溶液，在反室的小孔处形成磷脂双分子层膜，在磷脂双分子层膜形成过程中，通过电容监测其形成质量并利用电压考察磷脂双分子的机械强度，对所得磷脂膜施加400mV电压；
若磷脂双分子层膜被击破则应重新拉起，重新提拉后的磷脂双分子层膜的电容与被击破的磷脂双分子层膜的电容相同或更大，该磷脂双分子层膜能用于形成纳米孔；若所述电容减小则应继续施加400mV ；
⑤检测与重复，若磷脂双分子层膜在400mV电压下不能被击破，应用貂毛画笔将其刷破，再重新提拉成膜，重复步骤③和④，直至得到可用于形成纳米孔的磷脂双分子层膜；
(3)形成气单胞菌溶素纳米孔通道
在稳定的磷脂双分子层膜形成后，在所述顺室加入1-10 μ I气单胞菌溶素，施加电压使气单胞菌溶素嵌入所述磷脂双分子层膜，当气单胞菌溶素在磷脂双分子层膜上形成稳定的纳米通道时，离子流会发生跃升；在10mV电压下获得电流在50 土 5ρΑ的单个气单胞菌溶素纳米孔通道。
[0007]进一步，步骤(3)施加的电压范围为100_300mV。
[0008]进一步，所述制备方法能同时获得多个纳米孔，每增加一个纳米孔，10mV电压下电流值相应增加50±5pA。
[0009]为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案。
[0010]所述气单胞菌溶素纳米孔通道在DNA测序、DNA损伤、Micro-RNA检测中的应用。[0011 ] 进一步，所述气单胞菌溶素纳米孔通道在DNA测序、DNA损伤、Micro-RNA检测中的应用，其检测方法为:
(I)在纳米通道的两端施加电压，将待测分子加入检测池的一端，待测分子随离子流驱动进入气单胞菌溶素纳米孔，通过与气单胞菌溶素纳米孔的相互作用产生与其结构变化相对应的阻断电流信号； (2)改变施加在气单胞菌溶素纳米孔两端的电压，在不同电压下记录产生的阻断电流信号;
(3)对记录的信号的阻断时间、阻断程度、信号频率进行归类分析，获得待测分子的相应结构信息。
[0012]检测应用中所有测得的阻断信号(阻断事件)涉及两个重要参数:阻断电流和阻断时间。一个完整的阻断事件包括阻断电流从开孔电流处以一定幅值量子化阶跃至返回开孔电流，直到下一阻断事件的发生点，为一个轮回。因此，涉及相关的检测参数有四项:阻断时间(t)、阻断电流(i)、事件发生频率(f)和峰形。这四项检测参数直接反映了单个分子通过气单胞菌溶素纳米孔的过程。通过对阻断事件的统计分析，能够得到分子构型、分子通过模式、分子在通道内速率以及样品中待测分子浓度等多方面的信息。而改变检测条件，如改变分子长度、分子构象、外加电压、缓冲液浓度、溶液PH值和温度等，都将引起这四项检测参数的变化。
[0013]进一步，所述气单胞菌溶素纳米孔通道在DNA测序、DNA损伤、Micro-RNA检测中的应用，能实现单碱基分辨，即能区分仅具有一个碱基差别的DNA序列(如AGA、GGA、CGA、TGA) ο
[0014]进一步，所述气单胞菌溶素纳米孔通道在DNA测序、DNA损伤、Micro-RNA检测中的应用，能实现DNA测序:通过在气单胞菌溶素纳米孔内嵌入Y-环糊精的方式，使气单胞菌溶素纳米孔的有效孔道内径更小，具有更高的分辨率。
[0015]进一步，所述气单胞菌溶素纳米孔通道在DNA测序、DNA损伤、Micro-RNA检测中的应用，能实现DNA测序:以四个碱基为一个单元，对四种碱基的不同组合进行检测，根据每种组合对应的特征电流值确定DNA序列。
[0016]进一步，所述气单胞菌溶素纳米孔通道在DNA测序、DNA损伤、Micro-RNA检测中的应用，在气单胞菌溶素纳米孔通道口连接DNA剪切酶，在DNA通过气单胞菌溶素纳米孔的过程中实现对DNA边剪切边测定。
[0017]进一步，所述气单胞菌溶素纳米孔通道在DNA测序、DNA损伤、Micro-RNA检测中的应用，在气单胞菌溶素纳米孔通道口绑定phi29 DNA聚合酶，在DNA进入气单胞菌溶素纳米孔时与phi29 DNA聚合酶产生相互作用，降低DNA通过孔的速度。
[0018]进一步，所述气单胞菌溶素纳米孔通道在DNA测序、DNA损伤、Micro-RNA检测中的应用，可检测DNA损伤:包括碱基的替换、消失、插入；具体地可分为:
⑴碱基的异构互变，如烯醇式与酮式碱基间