上述预混的流式抗体加入到所得的细胞沉积中，2-8°C染色20min，流式缓冲液重悬后1500rpm离心5min，细胞重悬于300 μ I流式缓冲液，流式仪上机分选SSEA4+亚群细胞。
[0044]实施例3.骨相关间充质干细胞Scal+亚群具有支持造血重建的功能
[0045]1、筛选骨相关间充质干细胞亚群
[0046]1.1将分选后的Scal+亚群细胞、⑶271 +亚群细胞和SSEA4 +亚群细胞进行体外培养。培养条件:DMEM/F12+GlutaMAX?-l (IX)培养液(Gibco)，15 % (v/v)胎牛血清(Gibco), I % (v/v)丙酮酸钠(SODIUM PYRUVATE, SIGMA),I % (v/v)非必需氨基酸(MEMNEAA, GIBCO)、I % (ν/ν) β-疏基乙醇(2-Mercaptoethanol, GIBC0) ο
[0047]1.2培养5d后，镜下观察并分析细胞增殖情况，结果如图2所示。经检测，⑶271+亚群细胞和SSEA4+亚群细胞在体外不能进行增殖，而Scal +亚群可以再体外明显增殖。
[0048]2、小鼠LT-HSC细胞制备
[0049]2.1对骨髓细胞，红细胞裂解液冰上5min裂解红细胞，加入2倍体积的PBS, 1500rpm离心5min，重复一次后悬于10流式缓冲液，按每只小鼠加入0.1 μ I⑶16/32封闭抗体，冰上封闭5min ；
[0050]2.2按适当稀释比例，混合抗-CD150、抗-CD48、抗-seal、抗_c_kit、抗-CD135和抗-Lin(含抗-CD3、CD4、CD8、B220、CDllb、Grl 和 Terll9 抗体)流式抗体到 20 μ I 流式缓冲液，加到封闭后骨髓细胞悬液，2-8°C染色20min，流式缓冲液重悬后1500rpm离心5min，细胞重悬于300 μ I流式缓冲液，上机分选收集LT-HSC细胞；
[0051]3、骨相关间充质干细胞Scal+亚群参与支持造血重建
[0052]3.1将分选后的骨相关间充质干细胞Scal+亚群和LT-HSC细胞进行体外共培养48h?培养条件为:IMDM培养液(Gibco)，胎牛血清10% (v/v)，细胞因子10ng/ml (细胞因子:IL-1 a，IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, GM-CSF, TPO, ΕΡ0, SCF, Flt3L)(Franco et al., 2010).
[0053]3.2共培养后分选部分LT-HSC细胞，进行克隆形成实验、凋亡实验和细胞周期分析(Franco et al., 2010)；
[0054]3.38-12周龄的CD45.2 C57/B6小鼠，接受剂量为IlOORads照射；
[0055]3.4收集共培养的部分LT-HSC细胞，与辅助细胞CD45.2 C57/B6小鼠骨髓混合，悬于100 μ 1PBS，眼眶静脉注射到照射后受体小鼠体内(200个LT-HSC+辅助骨髓细胞为2 X 15剂/小鼠)，饮水中持续给予抗生素，连续两周；
[0056]3.5第4、8、12、16周眼眶静脉取血，裂解红细胞后封闭，用抗-CD45.1、抗-CD45.2、抗-CD3、抗-CD4、抗-CD8、抗-TCR-beta、抗-CD 19、抗-B220、抗-CDI Ib 和抗-Gr I 抗体染色，分析骨髓重建分化；
[0057]3.616周后处死受体小鼠，分离骨髓和外周血，流式分析骨髓重建，必要时进行二次骨髓移植，进行L中相同分析，结果如图3所示。
[0058]实施例4.骨相关间充质干细胞Scal+亚群治疗CRA模型小鼠
[0059]1、CRA模型小鼠的建立、鉴定及检测
[0060]1.1B16细胞用含10% FBS的RPMI 1640培养基培养，37°C，5 % CO2，环境中培养，每2-4天传代；选取对数生长期B16细胞进行造模。取该期B16细胞，吸取培养液，PBS液清洗2遍。用0.25%胰酶消化贴壁细胞4min后，加入含血清培养液终止反应，吹打贴壁细胞，得细胞悬液，1500r/min离心5min收集细胞，重悬于PBS液中。进行细胞计数，调整细胞悬液浓度调整到IxlOVml。
[0061]1.2将制备好的瘤液250 μ I于无菌条件下接种于C57BL/6小鼠背部皮下。瘤液接种后注意观察注射部分瘤灶的形成。瘤灶形成后每隔2天游标卡尺对瘤灶进行范围测量。测量最大直径(a)及与之垂直的横径(b)，以axb(mm2)表示，体积以(axb2/2)(单位mm3)计算。瘤液接种后14-16天，选择在注射部位形成瘤灶的C57BL/6小鼠，采外周血，用1%EDTA-Najjt凝，检测外周血中RBC、Hb、Hct (% )，野生型C57BL/6小鼠作为对照参考。当荷瘤小鼠的RBC、Hb、Hct(% )值低于野生型小鼠各检测值的20%以上时，可判定荷瘤小鼠发生了贫血，即CRA发生。
[0062]1.3小鼠骨髓中红系前体细胞检测:取CRA小鼠股骨和胫骨，去除所有肌肉组织，PBS冲洗骨头后，放于研磨杯内研磨至骨髓释放，分离收集骨髓；取60 μ m孔径滤网过滤，收集虑过液；加入适量ACK裂解红细胞，1500rpm离心5min ;弃上清，加入PBS混匀细胞，1500rpm离心5min后弃上清，重复一次；按适当稀释比例，混合抗_Terll9和抗-⑶71流式抗体到20 μ I流式缓冲液，加到封闭后骨髓细胞，2-8°C染色20min，流式缓冲液重悬后1500rpm离心5min，细胞重悬于300 μ I流式缓冲液，流式仪上机分析。
[0063]2.骨相关间充质干细胞及其Scal+亚群移植治疗CRA小鼠的效果检测
[0064]2.1骨相关间充质干细胞移植治疗CRA小鼠模型建立:取已经制备好的骨相关间充质干细胞混合群细胞用PBS溶液制备细胞悬液，调整细胞浓度到4xl06/ml ;将制备好的细胞悬液100 μ I于无菌条件下经静脉输注给C57BL/6小鼠；按上述CRA小鼠模型制备方法，将制备好的瘤液250 μ I于无菌条件下接种于输注过混合群细胞的C57BL/6小鼠背部皮下；瘤灶观察与贫血鉴定方法参考CRA小鼠模型建立方法。
[0065]2.2细胞移植治疗CRA小鼠模型建立
[0066]取经分选的Scal+亚群用PBS溶液制备成细胞悬液，分别调整细胞浓度到4x10 5/ml ;将制备好的细胞悬液100 μ I于无菌条件下经静脉输注给C57BL/6小鼠；按上述CRA小鼠模型制备方法，将制备好的瘤液250 μ I于无菌条件下接种于经上述细胞移植的小鼠背部皮下；瘤灶观察与贫血鉴定方法参考CRA小鼠模型建立方法，
[0067]2.3细胞移植治疗小鼠CRA的效果检测
[0068]通过比较野生型(Ctrl)，未治疗组(B16)、混合群治疗组(B16/MSC)和亚群治疗组(B16/Scal)小鼠的生存曲线、血常规指标、长骨图片以及骨髓中红系发育分化情况，评价细胞治疗作用，结果如图4，5，6，7所示。
[0069]实施例5.骨相关间充质干细胞Scal+亚群缓解aGVHD小鼠模型临床症状
[0070]1、aGVHD模型小鼠的建立
[0071]1.1骨髓细胞制备:分别取C57BL/6小鼠和BALB/C小鼠的股骨和胫骨，去除所有肌肉组织，PBS冲洗骨头后，减去两端骨骺，用充满PBS的注射器从骨一端注射进入，将骨干中的骨髓细胞冲洗出来，反复冲洗2-3次，收集骨髓细胞。取60 μ m孔径滤网过滤，收集滤过液；加入适量ACK裂解红细胞，1500rpm离心5min ;弃上清，加入PBS混勾细胞，1500rpm离心5min后弃上清，重复一次；细胞计数后，按适当稀释比例用PBS重悬细胞制备单细胞悬液。
[0072]1.2脾细胞制备:取C57BL/6小鼠的脾脏，去除结缔组织，PBS冲洗后，将组织剪成小块，用玻片进行研磨，收集脾脏细胞。取60 μ m孔径滤网过滤，收集滤过液；加入适量ACK裂解红细胞，1500rpm离心5min ;弃上清，加入PBS混匀细胞，1500rpm离心5min后弃上清，重复一次；细胞计数后，按适当稀释比例用PBS重悬细胞制备单细胞悬液。
[0073]1.3aGVHD模型小鼠的建立:经8.0Gy辐照处理的BALB/C小鼠作为受体，对照组(Ctrl)小鼠按1\10%么1^/(:小鼠骨髓细胞/只经静脉移植注射；实验组(BM)小鼠按I X 107C57BL/6小鼠骨髓细胞/只和6X 106C57BL/6小鼠脾脏细胞经静脉移植注射。
[0074]1.4aGVHD模型小鼠的观察:通过对小鼠的皮肤状态、活动力、行为姿势、体重以及毛发完整度等的观察，给予小鼠综合评分。
[0075]2、细胞移植缓解aGVHD模型小鼠的效果检测
[0076]将骨相关间充质干细胞混合群细胞及Scal+亚群细胞用PBS溶液制备细胞悬液，按8X 14/只静脉分别移植给经8.0Gy辐照处理的BALB/C小鼠，建立混合群治疗组(MSC)和Scal+亚群处理组(Seal+)。同时对该小鼠按I X 10 7C57BL/6小鼠骨髓细胞/只和6X106C57BL/6小鼠脾脏细胞进行静脉移植注射。对照组(Control)和实验组(BM)小鼠按前面的方法进行处理。通过对小鼠的皮肤状态、活动力、行为姿势、体重以及毛发完整度等的观察，给予小鼠综合评分，并判定骨相关间充质干细胞及其Scal+亚群细胞移植缓解aGVHD模型小鼠的效果，结果如图8，9所示。
【主权项】
1.骨相关间充质干细胞Scal+亚群的制备，其特征在于，包括:利用抗-⑶45抗体、抗-Terl 19抗体和抗-Scal抗体对骨相关间充质干细胞进行分选得到骨相关间充质干细胞Scal+亚群。
2.骨相关间充质干细胞Scal+亚群用于制备治疗肿瘤相关性贫血药物的应用。
3.骨相关间充质干细胞Scal+亚群用于制备缓解急性移植物抗宿主病药物的应用。
【专利摘要】本发明涉及骨相关间充质干细胞Sca1+亚群的制备及其应用，所涉及的制备包括利用抗-CD45抗体、抗-Ter119抗体和抗-Sca1抗体对骨相关间充质干细胞进行分选得到骨相关间充质干细胞Sca1+亚群。所涉及的应用之一是骨相关间充质干细胞Sca1+亚群用于制备治疗肿瘤相关性贫血药物的应用。所涉及的应用之二是骨相关间充质干细胞Sca1+亚群用于制备缓解急性移植物抗宿主病药物的应用。
【IPC分类】A61P37-06, C12N5-0775, A61P35-00, A61P7-06, A61K35-28
【公开号】CN104673746
【申请号】CN201510079958
【发明人】胡兴斌, 安宁, 文凡, 尹文, 张辉洁, 陈要臻
【申请人】中国人民解放军第四军医大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月13日