一种血小板裂解液的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及细胞生物学领域，特别设及一种血小板裂解液的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 间质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs)是成体干细胞的一种，具有干细胞 的共性和很强的自我增殖能力。MSCs具有良好的多向分化潜能，可用于特定组织器官的 损伤修复；能够参与构成支持造血的微环境，促进造血恢复，与造血干细胞共同移植能够降 低GV皿的发生率；具有免疫调节和易化移植的作用，免疫原性低，输注人体安全可靠；因此 MSCs在临床的应用研究越来越受到关注。骨髓、厮带血中MSCs含量极少，大约每10 4~10 5 单个核细胞中含有1个MSC。人体细胞治疗所需的细胞数量为1 X l〇7kg，一个50kg的成人 所需输注的细胞量为5X107。因此，MSCs在运用于临床之前，需在体外进行扩增。目前MSCs 的体外培养扩增体系主要是基础培养基添加一定浓度的胎牛血清，但有导致航病毒或者某 些未知动物传染病传播风险，及培养过程中动物源蛋白或肤对间充质干细胞免疫排斥的可 能，甚至输注后亦无明显疗效；有研究表明，MSC在培养过程中可吞瞻培养基中的蛋白，内 含牛血清蛋白，可使受者体内产生抗牛蛋白抗体，引起免疫反应，从而导致患者尤其在重复 输注干细胞治疗后治疗失效；且市售部分胎牛血清含有病毒，因此如何保障细胞培养的安 全性尤为关键。
[0003] 目前对人源细胞的体外培养体系进行了很多研究，培养基添加物，包括成人血清、 血小板衍生物、血小板裂解液、凝血酶激活血小板释放因子、厮血清等，已成为新的热点。为 了减少异种蛋白的污染，也可采用添加各种营养成分组成的完全的通用型的无血清培养 基，适用于培养贴壁和悬浮哺乳动物细胞；支持杂交瘤形成时的细胞融合，支持单核细胞、 巨瞻细胞、上皮细胞和成纤维细胞系的细胞生长。该些无血清培养基（Serum化ee Medium， SFM)都可在cGMPs洁净车间里生产，可W消除来自血清的不均一性，因而质量稳定；但有其 缺陷，配制无血清培养液必须使用高质量的水，在无血清培养基中通常要加入激素和生长 因子，有化学限定性，价格昂贵；细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影 响，培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便，针对性强，一种无血清培养基仅适合 某一类细胞的培养。而对于血清添加物，有采用胎牛血清等，成分不明确；保存期短（至多 一年），不能排除血清中含有易变物质；使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态， 可能促进某些细胞的生长（成纤维细胞）同时抑制另一类细胞生长（表皮细胞），血清含一 些对细胞产生毒性的物质，影响细胞生长，甚至造成细胞死亡；还可能带入支原体、病毒等 污染，对细胞产生潜在影响，可能导致疾病传染等；而且血清制作批间差异大，成分不能保 持一致，生产标准化困难，质量不稳定，价格昂贵，使用不方便。因此，研制替代培养用血清 的替代品具有重要的意义。
[0004] 血小板来源于人类，输注人体内不会引起异种蛋白的免疫，且能够释放多种生长 因子，在组织修复W及细胞生长等方面起着重要的作用，越来越多的研究者关注人血小板 裂解产物用于细胞培养的安全性和有效性。血小板含有=种主要的颗粒；a颗粒、致密颗 粒和溶酶颗粒，具有黏附、聚集及释放等多种生物功能。a颗粒是血小板内最大和最多的分 泌型颗粒，含有血管和组织形成过程中的重要生长因子。血小板在活化时会释放各种血小 板源性细胞因子，包括血小板衍生生长因子（PDGF)、成纤维细胞生长因子（FGF)、转化生长 因子（TGF - 0)、血管内皮细胞生长因子（VEGF)，该些生长因子可W刺激成纤维细胞、平滑 肌细胞和造骨细胞的增殖，并能吸引多种细胞成分参与损伤组织的修复，并可W诱导MSCs 及内皮细胞进行有丝分裂、分化及复制，可促进组织愈合。其中，PDGF是一种成纤维细胞的 有丝分裂原，能强力地诱导成纤维细胞的再生，增加肉芽组织内成纤维细胞的量，促进成纤 维细胞分化并诱导成纤维细胞分泌其他细胞因子，促进细胞基质成分（胶原、透明质酸等） 的合成、分泌，从而加速伤口的愈合，PDGF还能降低癒痕组织的形成。TGF-0参与体内许多 炎症反应和组织修复，是体内多功能的基础抗炎细胞因子。TGF-0的含量与胶原的合成、伤 口愈合时间、伤口愈合组织的张力、W及癒痕的密度有一定的关联。VEGF也称血管通透性因 子或促血管素，在创伤愈合血管生成过程中，尤其是毛细血管形成的早期阶段，内源性VEGF 基因表达明显增加，VEGF在新生毛细血管内皮细胞胞质内呈强阳性，能促进血管内皮细胞 的增殖和肉芽组织的形成。因此，利用血小板所含的该些细胞因子可W作为体外细胞培养 用的营养添加剂，人血小板裂解产物的研究越来越受到关注。
[0005] 许多研究表明，采用反复冻融法可获得用于细胞培养用的血小板裂解液（PL)，但 由于制备量小，对裂解产物中各种细胞因子含量的控制未有明确要求，导致其效果差异很 大；也有采用机采血小板来进行较大量制备的报道，但未研究如何进行有效的血小板活化 W达到最大限度地获得细胞因子，因此，如何进行有效的血小板活化成为了研究的热点。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明提供了一种血小板裂解液的制备方法及其应用。该血小板裂解 液的制备方法可明显提高血小板裂解液中细胞因子含量，且可进行细胞因子的定量平衡， 有利于减少产品批间的差异，可达到稳定的促进细胞生长的作用；采用本发明制备方法所 制备的血小板裂解液可代替小牛血清培养细胞；本发明采用健康献血者的血小板为原料， 且进行了严格的化验检查，从而保证了安全性。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明提供W下技术方案：
[000引本发明提供了一种血小板裂解液的制备方法，包括如下步骤：
[0009] 将血小板在20~24°C振荡保存1~5d，采用反复冻融法和超声法进行处理，离 屯、、收集上清液，去除纤维蛋白，获得血小板裂解液。
[0010] 本发明提供了一种采用反复冻融法和超声法复合方法促进血小板活化，W获得更 高水平细胞因子的血小板裂解产物大量制备方法，与反复冻融法或超声法等单一方法相 比，该制备方法可明显提高血小板裂解液中细胞因子含量，且可进行细胞因子的定量平衡， 有利于减少产品批间的差异，可达到稳定的促进人源性细胞生长的作用。
[0011] 作为优选，血小板为单采血小板或浓缩血小板。
[0012] 作为优选，所述超声的功率为100W~400W。
[001引优选地，超声的功率为200~300W。
[0014] 更优选地，超声的功率为285W。
[0015] 在本发明提供的一些实施例中，超声具体为：超声3~6s，停止超声3~6s。
[0016] 作为优选，超声具体为：超声5s，停止超声5s。
[0017] 在本发明提供的一些实施例中，超声的次数为5~15次。
[001引作为优选，超声的次数为10次。
[0019] 在本发明提供的一些实施例中，反复冻融具体为；在-80°C冻存2化，在37°C融解， 共冻融1~5次。
[0020] 作为优选，反复冻融为：在-80°c冻存2化，在37°C融解，共冻融3次。
[0021] 在本发明提供的一些实施例中，采用反复冻融法和超声法进行处理具体为；先采 用反复冻融法进行处理，然后采用超声法进行处理。但本发明并非限定于此种方式，先采用 超声法进行处理，然后采用反复冻融法进行