参见试剂说明书），以步骤2中提取获得的基因组DNA为模板，上述引物作为 扩增引物，通过PCR的方法进行扩增，PCR反应条件：
[0038] 预变性95 °C，2分钟；热循环条件是95 °C变性20秒，50 °C退火20秒，72 °C延伸30 秒，反应进行32个循环；最后在72°C保温延伸10分钟。
[0039] 通过PCR扩增的基因全长为2220bp，用1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测证实得到目的 基因DNA扩增产物后，使用DNA凝胶回收试剂盒（购于Omega公司）切胶回收，纯化所得扩 增产物。
[0040] 4、重组质粒的构建
[0041] 将上述纯化的DNA片段和载体pMAL-c2x用限制性内切酶BamHI和限制性内切酶 Sal I(购于Takara公司）进行双酶切，实验操作参见Takara产品说明书。酶切完毕后 用Cycle-pure kit(购于Omega公司）对酶切产物进行纯化。
[0042] 将上述纯化的基因片段和载体片段混合，在16°C下用Solution I (购自Takara 公司）进行过夜连接反应。将连接产物转入大肠杆菌E.coli DH5 a (购自Takara公司） 中，在含有100 μg/ml氨苄青霉素的固体LB平皿上涂布，37°C静置培养，直至出现单菌落， 选择性挑取单菌落在含有100 u g/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中37 °C振荡培养。菌液 PCR验证工程菌的重组质粒中含有目的片段。构建好的重组质粒pChu_2268委托华大基因 进行序列测定。测出序列与哈氏菌原基因进行比对，无碱基错误或移码突变，说明此工程菌 可以表达SEQ 4所述氨基酸序列的成熟蛋白CHU_2268。
[0043] 5、重组质粒在宿主菌中的表达
[0044] 将含有目的片段的重组质粒转入宿主菌E. coli JM109(购自Takara公司）中，选 取阳性克隆于含氨苄青霉素的液体培养基中过夜培养，次日以2%接种量接入新鲜培养基， 37°C震荡培养至0D_为0. 4至0. 6之间，加入异丙基硫代-D-半乳糖苷（IPTG)，终浓度 为0. 3mM，18°C，80rpm低速振荡培养15小时左右，离心收集菌体，制得IPTG诱导的工程菌， 然后超声破碎，12,000g，离心15min，所得上清进行12% SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳，显示有 目的蛋白的表达。经亲和层析纯化后，以pNPG为底物，以410nm处吸光度检测pNP的产量， 测得纯化所得蛋白处理过的PNPG有大量pNP产生，即我们通过异源表达的到了具有活性的 CHU_2268〇
[0045] 6、其他该纤维寡糖酶的表达方法
[0046] 除了可以用上述方法表达该纤维寡糖酶以外，可以采取其他的生物手段进行表 达。
[0047] 可以通过将编码该纤维寡糖酶的基因整合至宿主的染色体上，或者是选用其他载 体或是宿主细胞，比如其他细菌或是真菌。其他的宿主细胞及载体载有本发明涉及的多功 能纤维素酶基因后，同样可以表达、产生本发明所涉及的多功能纤维素蛋白，这样的生物体 就变成能表达、生产该多功能纤维素酶的基因工程菌或是基因工程细胞。
[0048] 实施例2 :葡萄糖耐受纤维寡糖酶的纯化
[0049] 将上述IPTG诱导的工程菌离心收集菌体，用超声缓冲液（20mM Tris-HCl，ImM EDTA-Na2,200mM NaCl，pH 7. 4)重悬，后超声破碎，所得破碎液，12,000g离心15min，得上 清，即为粗酶液，过麦芽糖结合蛋白亲和层析柱（Amylose Resin)，具体操作参见NEB操作 手册，即可得到纯化的纤维寡糖酶CHU_2268。纯化结果如图1所示。
[0050] 实施例3 :重组纤维寡糖酶的性质
[0051] (1)纤维寡糖酶的最适反应温度及pH
[0052] 本发明所涉及纤维寡糖酶的最适反应温度以及pH是以pNPG为底物反应，反应 30min后进行检测。最适反应pH的检测如下：以0.2mMpNPG为底物，缓冲液为不同pH的 Na2HP04/KH2P0 4(50mM)，加人适量的S|，30°C反应 30min 后，加人 200yl Na2C03(10%，W/v) 终止反应，以410nm处吸光值表示pNP的产生。最适反应温度的检测则是在最适反应pH下， 于不同温度进行反应。
[0053] 经检测，本发明所涉及的纤维寡糖酶最适反应pH为6. 8,最适反应温度为30°C。结 果如图2所示。
[0054] (2)纤维寡糖酶对pNPG以及pNPC的降解
[0055] 以 0? 5 % (w/v)的 pNPG 或 pNPC 为底物，磷酸缓冲体系（Na2HP04/KH2P04, 50mM，pH 6. 8)，30°C下反应不同时间，用薄层层析的方法检测产物的生成或检测405nm处的吸光值 表示pNP的产量。
[0056] 实验检测表明，本发明所涉及的纤维寡糖酶可以降解pNPG和pNPC，终产物都为 pNP和葡萄糖，在降解pNPC初期产物主要为pNPG和葡萄糖，说明CHU_2268以外切方式降解 pNPC。而且在降解pNPC的反应初期有较长链的pNPG3产生，说明CHU_2268也具有转糖基 作用。结果如图3所示。
[0057] (3)纤维寡糖酶对纤维二糖及纤维寡糖的降解
[0058] 以1% (w/v)的纤维二糖或是纤维寡糖为底物，30°C下反应不同时间，用薄层层析 的方法检测还原糖的产生。
[0059] 本发明所涉及的纤维寡糖酶可以降解纤维二糖以及纤维三糖、纤维四糖和纤维五 糖等纤维寡糖，终产物都为葡萄糖。结果如图4所示。
[0060] (4)纤维寡糖酶对葡萄糖的耐受性
[0061] 以〇.2mMpNPG为底物检测纤维寡糖酶的葡萄糖耐受性，于磷酸缓冲体系 (Na2HP0 4/KH2P04,50mM，pH 6.8)，30°C下反应30min，反应体系中加入不同浓度的葡萄糖，以 反应结束后410nm处的吸光值表不pNP的产生量。
[0062] 本发明所涉及的纤维寡糖酶在较高浓度的葡萄糖条件下（葡萄糖浓度为底物 pNPG浓度的100倍）仍然具有约40%酶活力。结果如图5所示。
[0063]由以上结果可以看出，本发明所涉及的纤维寡糖酶对葡萄糖具有较高的耐受性， 可以一定程度地解决现有的纤维寡糖酶以及葡萄糖苷酶被产物反馈抑制的问题，积累 较高浓度的产物葡萄糖，在能源以及化工领域有较好的应用前景。
【主权项】
1. 一种葡萄糖耐受的纤维寡糖酶CHU_2268在降解纤维素中的应用，所述葡萄糖耐受 的纤维寡糖酶CHU_2268的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，葡萄糖耐受的纤维寡糖酶CHU_2268降解纤 维寡糖和纤维二糖。
【专利摘要】本发明涉及一种葡萄糖耐受的纤维寡糖酶的应用。一种葡萄糖耐受的纤维寡糖酶CHU_2268在降解纤维素中的应用，所述葡萄糖耐受的纤维寡糖酶CHU_2268的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明获得具有纤维寡糖酶活性的蛋白，有效地解决了哈氏菌生长周期长，酶成分比较复杂，产量较低，不容易对纤维素酶直接进行分离纯化的问题。该酶不仅可以降解纤维二糖,对纤维寡糖也有较高的降解能力,而且具有较高的葡萄糖耐受性，在生物能源等工业中具有比较大的应用潜力。
【IPC分类】C12P19-02, C12P19-14
【公开号】CN104673857
【申请号】CN201510080021
【发明人】卢雪梅, 张聪, 张为灿
【申请人】山东大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月13日