鉴别白肉灵芝的特征性核苷酸序列、核酸分子探针和方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及利用分子生物学方法鉴别珍稀食药用菌品种的领域，尤其涉及一种鉴别白肉灵芝的特征性核苷酸序列、核酸分子探针和鉴别方法。
【背景技术】
[0002]灵芝是中国名贵中药材，灵芝在我国已有2000多年的药用历史，被历代医药家视为滋补强壮、扶正固本的神奇珍品，经过大量临床研宄，灵芝具有调节免疫、抗肿瘤、保肝解毒、防治心血管系统疾病、抗衰老、抗神经衰弱、降血糖血压、抗过敏等等功效。
[0003]白肉灵芝(Ganoderma leucocontextum T.H.Li, ff.Q.Deng, Sheng H.Wu, DongM.ffang&H.P.Hu)是新发现的中国特有灵芝属新种，于2014年发表于((Mycoscience))上，该新种是由广东省微生物研宄所助理研宄员胡惠萍等人于2011年在调查西藏林芝地区的野生食药用菌资源时，采集到的生长在青R树上的野生灵芝。白肉灵芝:菌盖10-20X5-10cm,近柄处厚2_3cm，肾形、半圆形扇形，大部分红至红褐色，幼嫩时及成熟时边缘白至浅黄色，渐变黄至红褐色，成熟后接近菌柄部分呈暗红褐色、暗紫红褐色或几乎黑红褐色，具漆样光泽，具同心环纹，常有弱的放射状皱纹。孔口表面新鲜时白色至奶油色，受伤处带褐色至褐色。孔口近圆形，每毫米4-6个。菌管长达4-6_，不分层，赭色到淡灰褐色或灰褐色。菌肉厚达2.2cm，白色，干后白至近白色或微带奶油色，软木栓质至木栓质，近表皮有一薄的带褐色紧密层(皮壳)。菌柄5-8X3.5-5.5cm，圆柱形至略扁，侧生至偏生，有时近无柄，暗红褐色至暗紫褐色，具光泽，内部白色。孢子广椭圆形，顶端平截，浅褐色，双层壁，内壁具小刺，非淀粉质，9.5-12.5X7-9 μm(包括最外孢层)，8.0-9.0*5-6.5 μπι(不包括最外孢层)。夏秋季散生至群生长于青同树Cyclobalanopsis glauca(Thunb.) Oerst.腐木上，常靠近树干基部。分布于西藏与四川等西南地区。药用，与灵芝G.1ingzhi ShengH.Wu et al.混淆使用。(摘自《Ganoderma leucocontextum, a new member of theG.1ucidum complex from southwestern China》)。
[0004]白肉灵芝在形态特征上与赤芝(Ganoderma Iucidum)、漆光灵芝(Ganodermalucidum)和四川灵芝(Ganoderma sichuanense)均较相似，因此在没有被定为灵芝属新种之前，白肉灵芝长久以来被当成赤芝在川藏一带广为利用。白肉灵芝的多糖含量远远高于市场上流通的赤芝，三萜含量也高于多数赤芝品种，具有较好的开发利用价值。因此，快速且准确地鉴别白肉灵芝菌丝体、子实体及其相关制品真伪的方法和技术是新种白肉灵芝商业化生产的重要技术保障，对白肉灵芝的开发利用具有重要的意义。
[0005]DNA是生物遗传信息的载体，每个生物物种乃至个体均具有独特的特征性核苷酸序列，且具有一定的稳定性，不会受到环境或培养等条件的影响而改变，是该生物物种或个体区别于其它生物物种或个体的重要标志，因而是用来鉴定物种或个体的可靠依据。随着分子生物学技术的快速发展以及计算机辅助分析技术的诞生，真菌的快速检测已成为可能。目前，尚未见任何鉴别白肉灵芝的核苷酸特征性序列、核酸分子探针及方法。
【发明内容】
[0006]针对以上不足，本发明的目的之一在于提供一种用于鉴别白肉灵芝的特征性氨基酸序列SEQ ID N0.1，该序列来自于白肉灵芝的核糖体DNA的内部转录间隔区(internaltranscribed spacer， ITS)。
[0007]上述序列SEQ ID N0.1可以通过多种方法获得，如实施例1所述的方法，也可以通过人工合成的方法通过DNA合成仪合成得到。
[0008]本发明的目的之二在于提供一种用于鉴别白肉灵芝的核酸分子探针，该核酸分子探针包括如下:
[0009]BRLZ-F: 5’-AGATCTGCGAAGCGTGCT-3’ ；
[0010]BRLZ-R: 5，-AGAGGAGCCGACCGACAG-3，。
[0011]上述核酸分子探针是以白肉灵芝的特征性氨基酸序列SEQ ID N0.1为基础，设计出的专一性极强的用于鉴别白肉灵芝的核酸分子探针，经实验证实，该核酸分子探针专一性强，只与白肉灵芝的DNA进行PCR反应而不与灵芝属的其它品种如赤芝、紫芝、中国灵芝、四川灵芝、日本灵芝等等的DNA发生PCR反应，因此，利用该探针通过PCR方法即可对白肉灵芝进行快速准确的鉴别。
[0012]本发明的目的之三在于提供一种鉴别白肉灵芝的试剂盒，包括核酸分子探针和PCR反应试剂，核酸分子探针为:
[0013]BRLZ-F: 5’-AGATCTGCGAAGCGTGCT-3’ ；
[0014]BRLZ-R:5，-AGAGGAGCCGACCGACAG-3，。
[0015]进一步的，一种优选的鉴别白肉灵芝的试剂盒，还包括灵芝属属真菌核糖体rDNA的内转录间隔区通用引物ITSl:5’ -TCCGTAGGTGAACC TGCGG-3’和ITS4:5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。该通用引物可以作为鉴别白肉灵芝的DNA的PCR扩增的阳性对照，用以确定PCR扩增体系是否正常。
[0016]本发明的目的之四在于提供一种鉴别白肉灵芝的方法，采用上述核酸分子探针BRLZ-F和BRLZ-R作为PCR引物，利用PCR方法对白肉灵芝进行鉴别。
[0017]进一步的，一种优选的鉴别白肉灵芝的方法，还包括采用上述通用引物ITSl和ITS4作为PCR引物，作为上述PCR方法的阳性对照，该阳性对照可以用于指示PCR反应体系是否正常。
[0018]本发明基于白肉灵芝的特征性核苷酸序列SEQ ID N0.1，设计了一对特异性核酸探针BRLZ-F和BRLZ-R，以该核酸探针为引物，以白肉灵芝的DNA为模板进行PCR扩增，从而实现对白肉灵芝的快速鉴别。实验证实，本发明的核酸分子探针专一性强，鉴别方法迅速准确，方法简单且特异性好。
【附图说明】
[0019]图1是实施例1的白肉灵芝的特征性核苷酸序列和在其基础上设计的实施例2的核酸分子探针。
[0020]图2是实施例3的白肉灵芝的核酸分子探针BRLZ-F和BRLZ-R作引物PCR方法鉴别白肉灵芝得到的核苷酸序列。
[0021]图3是实施例6对灵芝属的11种菌种共14种样品进行鉴别的PCR产物电泳图谱。
[0022]其中，M:DNA Marker D ;1:白肉灵芝野生子实体；2:白肉灵芝野生分离种；3:白肉灵芝驯化子实体；4:白肉灵芝驯化后再分离菌种；5-6:赤芝(G.lucidum) ；7:紫芝(G.sinense) ;8:中国灵芝(G.1ingzhi) ;9_10:四川灵芝(G.sichuanense) ;11:日本灵芝(G.japonicum) ； 12:树舌灵芝(G.appIanatum) ； 13:有柄树舌(G.gibbosum) ； 14:弯柄灵芝(G.flexipes) ； 15-16:无柄灵芝(G.resinaceum) ；17:紫铜灵芝(G.cupreum)。
【具体实施方式】
[0023]以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
[0024]实施例1:白肉灵芝的特征性核苷酸序列的获得
[0025]1.白肉灵芝基因组DNA模板的提取:
[0026]将白肉灵芝接种于PDA平板上，250C暗培养7_10天，收集菌丝体，研磨成粉后按照Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒(真菌)的说明书，进行总DNA提取，获得白肉灵芝的基因组总DNA模板。<