生物合成途径、重组细胞和方法
【专利说明】生物合成途径、重组细胞和方法
[0001] 相关申请的交叉引用 本申请要求于2012年5月29日提交的美国临时专利申请顺序号61/652, 505的优先 权，其通过引用结合到本文中。
[0002] 概述 本公开内容一方面描述了重组细胞，其经修饰而表现出与野生型对照相比酯的生物合 成增加。所述重组细胞可以是真核细胞或原核细胞。在某些情况下，所述微生物细胞可以 是光合的。在某些情况下，所述微生物细胞可以是分解纤维素的。在某些实施方案中，所述 重组细胞可以表现出与野生型对照相比有机酸向酰基辅酶A的转化增加，与野生型对照相 比酮酸向酰基辅酶A的转化增加，与野生型对照相比醛向有机酸的转化增加，与野生型对 照相比醛向醇的转化增加，或与野生型对照相比酰基辅酶A与醇结合形成酯的增加。
[0003] 另一方面，本公开内容描述了方法，其通常包括在使经修饰而表现出与野生型对 照相比酯的生物合成增加的重组细胞有效产生酯的条件下在包含碳源的培养基中孵育所 述重组细胞，其中所述碳源包括以下的一种或多种：葡萄糖、丙酮酸、酮缬氨酸、co 2、纤维 素、木糖、蔗糖、阿拉伯糖或甘油。
[0004] 另一方面，本公开内容描述了通常包括将异源多核苷酸引入宿主细胞的方法，所 述异源多核苷酸编码催化将碳源转化为酯的步骤的至少一种多肽，其中所述至少一种多核 苷酸与启动子操作性连接，使得所述修饰的宿主细胞催化碳源向酯转化。在某些实施方案 中，所述碳源可包括以下的一种或多种：葡萄糖、丙酮酸、酮缬氨酸、co 2、纤维素、木糖、蔗 糖、阿拉伯糖或甘油。在某些实施方案中，所述宿主细胞可以是真核细胞。在其它实施方案 中，所述宿主细胞可以是原核细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞可以是光合的。在某 些实施方案中，所述宿主细胞可以是分解纤维素的。
[0005] 本发明的以上概述无意描述本发明的每个公开的实施方案或每种实施。以下描述 更详细地举例说明了说明性的实施方案。在本申请全文的若干处，通过实施例列表提供指 导，可以不同组合使用所述实施例。在每种情况下，给出的列表仅作为代表性的群组，而不 应视为排他性的列表。
[0006] 附图简述 图1. (a)所提出的人工生物合成酯的途径。（b)实例分子。（c)用作燃料和化学品 的酯的优势。
[0007] 图2.酯异丁酸异丁酯的示例性的合成途径。两个独立的途径可导致异丁酰辅酶 A的产生。
[0008] 图3. (a)质粒和（b)气相色谱数据结果，显示了异丁酸异丁酯的生物合成。
[0009] 图4.产生乙酸异丁酯（IBAC)和乙酸异戊酯（IVAC)的合成途径。所述途径的工 程化步骤在框图中显示。NADPH-依赖性酶用虚线圈表示，关键性酶酰基转移酶用虚线长方 形表示。缩略语：PDC (丙酮酸脱氢酶复合物），AAT (醇酰基转移酶）；其它酶在图5中说 明。
[0010] 图5.对于（a)乙酸异丁酯（IBAC) (b)乙酸异戊酯（IVAC)的产生的合成的操纵 子。缩略语:AAT (醇酰基转移酶）。
[0011] 图6.对于（a)乙酸异丁酯的产生和（b)乙酸异戊酯的产生，引入5种候选的酰 基转移酶（AAT)的发酵结果。误差棒表示标准偏差。这5种AAT及其天然底物见表3。
[0012] 说明性实施方案的详述 在以下示例性的实施方案的描述中，说明了某些代谢酶和这些酶的天然来源。这些仅 仅是合适酶和指定酶的合适来源的实例。具有类似催化活性的替代的酶是可能的，作为可 得自不同微生物物种或菌株的同系物。因此，本文所述的示例性的实施方案不应视为限制 反映在权利要求书中的微生物或方法的范围。对于替代石油的可再生来源的搜寻是对科 学、工业和社会的重大挑战。生物合成可从生物质资源提供燃料和化学品的可持续的供应。 可影响发酵过程可行性的因素包括例如，原料可用性、发酵性能（例如，收率、效价、生产能 力）和回收发酵产物的成本。尽管在原料开发上已经取得巨大进展，但是目前生产醇或有 机酸的发酵方法仍不理想。首先，醇和有机酸对细胞具有很大毒性，这可限制这些产物在对 培养物中的微生物活力产生有害影响之前在发酵培养基中可积累的浓度。其次，醇和酸在 水性介质（例如培养基）中趋于极易溶解，因此可能需要消耗大量能源的蒸馏纯化方案以 从水性发酵介质中回收这些产物。结果，尽管作为燃料而言较高级的醇例如丁醇可以提供 优于例如乙醇的优势，但是作为商业可用的生物燃料而言较高级的醇难以与乙醇竞争，因 为从低的发酵效价（〈20 g/L)中高的纯化成本。第三，产生有机酸的发酵通常包括向发酵 中加入碱，以中和其中积累有机酸的培养基的pH值。有机酸的回收通常包括随后加入硫酸 并处理盐，这每一步都会涉及巨大成本。
[0013] 为了提供通用溶液，我们已经开发了用于生产醇、有机酸或其它生物燃料的酯平 台。如图1(a)所示，该方法的一个实施方案具有3部分：1)羧酸和随后的酰基辅酶A的生 物合成的代谢途径；2)醇生物合成的平行代谢途径；和3)从酰基辅酶A和醇生产酯的工 程化途径。该平台的成功实践使得基于生物的酯生产成为可能。在某些替代实施方案中， 所述方法可包括羧酸（和随后的酰基辅酶A)生物合成的代谢途径以及从生物合成的酰基 辅酶A和作为共反应剂而提供（例如在培养基中）的醇中生产酯的工程化途径。在其他替 代实施方案中，所述方法可包括醇生物合成的代谢途径以及从生物合成的醇和作为共反应 剂而提供（例如在培养基中）的酰基辅酶A中生产酯的工程化途径。
[0014] 通过使用我们的平台技术产生的酯可用作生物燃料、工业化学品或生产其他化合 物的原料。例如，可以容易地水解酯类，制备醇和有机酸。原则上，该方法可用于从按照我们 的平台工程化的微生物所产生的合适的酯制备任何醇和/或有机酸。若干示例性的有机酸 和醇列于图1(b)。示例性的有机酸产物包括例如，乙酸、异丁酸、3-羟基丙酸、丁酸、乳酸、 甲基丙烯酸、丙烯酸和异戊酸。示例性的醇产物包括例如乙醇、甲醇、丁醇、异丁醇、丙醇、异 丙醇、戊醇、异戊醇、己醇、庚醇和辛醇。任何这些酸以及任何这些醇的组合都可产生酯代谢 物。
[0015] 如本文所述而产生的酯可用作生物燃料。一般而言，酯类作为燃料的话，可提供 优于例如乙醇的某些优势。如表1所示，酯燃料具有与较高级的醇例如异丁醇和异戊醇类 似的能量密度。与相应的醇化合物相比，酯类还可表现出较低的水溶性，允许使用相分离 (而非蒸馏）从水性介质中回收酯类。结果，与从发酵中回收醇类相比，回收酯类可以是更 简单，更有效和成本更低廉。尽管脂肪酸类和烷烃类也具有非常低的水溶性，但长链脂肪酸 通常不有效分泌到胞外环境中，而且从这些化合物中制备的燃料可能在低温时无法顺利使 用，因为它们可能易于胶凝。
[0016] 酯的生物生产可以产生高于较高级醇、烷烃和脂肪酸的生物生产的理论收率。在 大肠杆菌中，例如，在发酵期间无原位回收时异丁醇积累可达到大约22 g/L (Baez等人， Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011，90 (5)，1681 - 1690)。相比之下，我们可以生产 90 g/L异丁酸，这可与乳酸（Wang等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011，108 (47)， 18920 -18925)或琥珀酸发酵（Lin等人，Metab.