使用非干扰性噪音消除性多核苷酸鉴定标签的多重焦磷酸测序的制作方法
【专利说明】使用非干扰性噪音消除性多核苷酸鉴定标签的多重焦磷酸 测序
[0001] 相关f献的夺叉引用
[0002] 本申请要求2012年9月24日提交的，标题为"使用非干扰性噪音消除性多核苷酸 鉴定标签的多重焦磷酸测序"的美国临时申请号61/705, 089的优先权，其通过引用并入本 文。
[0003] 序列表
[0004] 本申请含有序列表，其以ASCII格式通过EFS-Web提交并且在此以其整体通过参 考并入。2013年9月23日建立的所述ASCII拷贝命名为15892-0002_SL.txt并且大小为 I 5, 781 字节。 发明领域
[0005] 本发明涉及分析和测序核酸样品的方法学。更具体地，本发明涉及通过使用特异 性多核苷酸鉴定标签测序扩增的核酸样品的方法。
[0006] 发明背景
[0007] 核酸扩增方法学的发展，例如聚合酶链反应（PCR)，使得DNA扩增用于多种用途， 包括分子诊断试验。然而，存在与PCR用于分子差别诊断（MDD)测定相关的挑战。PCR使用 特异性引物或引物组、温度条件、和酶。例如，PCR反应容易被污染，引物结合对于不同引物 可能需要不同条件并且引物应该特异性于靶序列从而仅扩增该靶序列。这些限制使得更加 难以从单一样品扩增多个序列。
[0008] 过去，用于发现一种或多种致病病原体的临床样品诊断试验需要该微生物被分离 或培养。然而，这可能耗费数天，并且在很多情况中，如果要挽救患者的生命诊断，必须在几 小时内进行。分析单个临床样品以鉴定多种微生物从而确定哪个（那些）可能是疾病的病 原体，是MDD所需方法，并且已经开发出方法以更好地实现该目的。例如，已经开发了多重 PCR方法来扩增样品内的多种核酸，从而产生足够的DNA/RNA，使得能够检测和鉴定多种微 生物。然而，多重PCR具有缺点。例如，多重PCR反应中的各个靶需要其自身的最佳反应条 件，因此增加靶数量需要用于各个个体靶的反应条件是欠佳的。此外，系统中多组高浓度引 物常常产生引物二聚体或产生非特异性、背景扩增。这种特异性的缺陷还需要PCR后清理 和多次杂交后洗涤的额外步骤。
[0009] 由于需要可用的酶和消耗底物，聚集的引物降低扩增效率。扩增效率的差异可以 导致扩增子产量的显著差异。例如，一些位点可以非常高效地扩增，而其它的非常无效率地 扩增或根本不能扩增。该不均匀扩增的可能还使得难以精确进行进行终点定量分析直到不 可能精确进行进行终点定量分析。
[0010] 经常，时间是至关重要的，患者感染包括多于一种细菌物种，并且临床样品中靶 DNA的量是有限的。已经开发了技术比如多重PCR以解决该问题。然而，仍然需要该领域中 的改善，从而进一步减少完成快速和精确临床样品分析所需的时间和努力。可以自动的，特 别是通过使用用于样品制备和分析的封闭盒的方法，是特别重要的，因为它们可以提供附 加的优势：减少样品的可能污染和减少实验室技术人员在制备和分析各样品方面必须花费 的时间和努力。
[0011] 尽管在多重测序技术和它们在样品分析方面已经有显著的进步，如果这些能够被 进一步改善以使分析和检测更容易，将会是高度有益的。
[0012] 发明概沭
[0013] 本发明涉及用于分析可以包含混合DNA或RNA群体的样品的多重方法，所述方法 包括使用多核苷酸扩增以产生其中一种或多种靶序列用非干扰性、非消除性靶特异性多核 苷酸鉴定标签标记的扩增产物，和通过非干扰性、非消除性靶特异性多核苷酸鉴定标签序 列焦磷酸测序所述扩增的产物来检测一种或多种特异性多核苷酸鉴定标签的存在，特异性 多核苷酸鉴定标签的存在与特异性靶序列的存在相关联。在一个实施方案中，所述多核苷 酸可以包括DNA，RNA或混合的DNA/RNA群体。在另外的实施方案中，所述多重反应包括PCR 反应。
[0014] 本发明的方面还涉及用于分析含有一种或多种未鉴定多核苷酸的样品的多重方 法，所述方法包括以下步骤：将靶特异性引物连接于靶独特的非干扰性、非消除性多核苷酸 鉴定标签，将所述靶特异性引物杂交于靶多核苷酸序列，进行多核苷酸扩增来扩增所述靶 多核苷酸序列并且将靶独特的非干扰性、非消除性多核苷酸鉴定标签添加于所述靶多核苷 酸序列，并且焦磷酸测序所述靶独特的非干扰性、非消除性靶特异性多核苷酸鉴定标签，其 中鉴定出靶独特的非干扰性、非消除性靶特异性多核苷酸鉴定标签，表明靶多核苷酸的存 在。在一个实施方案中，所述多核苷酸可以包括DNA，RNA或混合的DNA/RNA群体。此外，所 述多重反应包括PCR反应。
[0015] 本发明的方面还涉及多重PCR焦磷酸测序方法，其中所述靶独特的非干扰性、非 消除性多核苷酸鉴定标签选自由以下各项组成的序列组：SEQ ID N0 :1，SEQ ID N0 :2, SEQ ID NO ：3, SEQ ID NO ：4, SEQ ID NO ：5, SEQ ID NO ：6, SEQ ID NO ：7, SEQ ID NO ：8, SEQ ID N0：9,SEQ ID NO： 10, SEQ ID NO： 11, SEQ ID NO： 12, SEQ ID NO： 13, SEQ ID NO： 14, SEQ ID NO ：15, SEQ ID NO ：16, SEQ ID NO ：17, SEQ ID NO ：18, SEQ ID NO ：19, SEQ ID NO ：20, SEQ ID NO ：21, SEQ ID NO ：22, SEQ ID NO ：23, SEQ ID NO ：24, SEQ ID NO ：25, SEQ ID NO ：26, SEQ ID NO ：27, SEQ ID NO ：28, SEQ ID NO ：29, SEQ ID NO ：30, SEQ ID NO ：31, SEQ ID NO ： 32, SEQ ID NO ：33, SEQ ID NO ：34, SEQ ID NO ：35, SEQ ID NO ：36, SEQ ID NO ：37, SEQ ID NO ：38, SEQ ID NO ：39, SEQ ID NO ：40, SEQ ID NO ：41, SEQ ID NO ：42, SEQ ID NO ：43, SEQ ID NO ：44, SEQ ID NO ：45, SEQ ID NO ：46, SEQ ID NO ：47, SEQ ID NO ：48, SEQ ID NO ：49, SEQ ID NO ：50, SEQ ID NO ：51, SEQ ID NO ：52, SEQ ID NO ：53, SEQ ID NO ：54, SEQ ID NO ： 55, SEQ ID NO :56, SEQ ID NO :57, SEQ ID NO :58, SEQ ID NO :59,和 SEQ ID NO :60。
[0016]本发明的一个方面使用嵌套靶特异性引物。靶核酸可以包含DNA和/或RNA，并 且可以包括病毒、细菌和/或真菌来源的DNA和/或RNA，以及人或其它动物来源的基因组 DNA和/或RNA。扩增可以通过聚合酶链反应（PCR)和/或RT-PCR进行。靶核酸的来源可 以源自一种或多种临床、环境、或食物样品并且所述方法可以以多种方式使用，包括，例如， 临床诊断、环境取样、植物测试、食品安全分析、遗传疾病检测、和/或疾病病状检测。所述 方法可以用于人和/或兽医学诊断。
[0017]附图简沭
[0018]图1是用于使用PCR连接靶特异性或靶独特性多核苷酸鉴定标签的方法的实例的 说明。在图1中，"索引标签"表示靶特异性（靶独特性）多核苷酸鉴定标签。Fo, Fi，Fc， Ro, Ri，和Rc表明引物序列和位置。
[0019]详细说明
[0020] 焦磷酸测序是基于核酸合成过程中释放的焦磷酸盐的检测的核酸测序技术。在该 酶促反应过程中产生可见光，如果整合入核苷酸，其与数量呈比例。作为由酶聚合酶导致的 核苷酸并入的结果无机焦磷酸盐被释放。在一些实施方案中，使用荧光素酶产生光，所述光 容易通过光电二极管，光电倍增管，或电荷稱合设备（CCD)相机检测。由于添加的核苷酸已 知，因此模板核酸的可以序列被确定。用DNA和RNA二者焦磷酸测序都是可能的。基本上， 所述方法允许通过一次一个碱基合成其互补链测序单链单链核酸，和通过测量核苷酸整合 过程中发出的光检测每一步哪个碱基被添加。焦磷酸测序代表用于来自细菌、病毒、真菌和 其它类似来源的核酸应用以从临床样品辅助鉴定的快速、精确方法。然而，焦磷酸测序是平 行-测序方法-一般需要多种平行测序运行来分析混合样品。在单个容器中进行该测序方 法（如用多重PCR测序方法），能够显著降低产生所需结果所需的成本和时间。本发明人已 经开发了方法，所述方法将允许焦磷酸测序以真正的多重方式进行-在单一多重反应中测 序和检测多个样品，而不是多个平行反应。
[0021]本发明人认识到，焦磷酸测序的优势-测序结果的检测是基于在DNA合成过程中 添加的核苷酸产生的释放的焦磷酸盐发出的光的事实-总体上排除了多重PCR和测序的 使用，因为多个不同的序列的检测变得相对不可能。然而，他们已经开发出克服该障碍的 方法。这样做时，他们已经产生可以在单个盒的限制内进行的用于多重多核苷酸扩增和焦 憐酸测序的方法，比如在 W0/2010/132834(Apparatus for Performing Amplicon Rescue Multiplex PCR(用于进行扩增拯救多重PCR的装置））中描述的方法中使用的那种盒，其在 本文以其整体通过引用并入。
[0022] 要理解，术语"包含（comprising) "，如本文使用的，可以用术语"基本上由….构 成"和"由...构成"替代。使用术语"反应体系"处，意在描述Eppendorf管，反应室，或其 它容器装置，其中放置必要引物、酶、核苷酸、缓冲液和/或其它试剂，从而进行一个或多个 循环的至少一种聚合酶链反应。不同"反应体系"可以因此指相同反应容器，但用于进行所 需扩增步骤的不同试剂组分-特别是引物。"反应容器"意在指管、板孔、或其它具有充足内 部容积以含有引物、酶、核苷酸、缓冲剂和/或提供反应体系所需的其它试剂的容器。术语 "拯救"意在指从第一次扩增的至少部分引物中分离扩增子。"PCR"意在指聚合酶链反应， 并且可以包括PCR和/或RT-PCR过程。
[0023]在一个实施方案中，本文描述的方法包括使用多核苷酸扩增来产生扩增的产物， 其中一种或多种靶序列用非干扰性、非消除性靶特异性多核苷酸鉴定标签标记。"非干扰 性、非消除性靶特异性多核苷酸鉴定标签"，如本文定义的，指当结合靶序列或引物时，不干 扰聚合酶的功能，不改变位于核苷酸模板或引物的末端的核苷酸结构，不干扰引物对模板 的退火，不在靶多核苷酸中引入复合体结构，或另外不干扰或阻止引物的结合和/或靶核 苷酸的扩增的多核苷酸序列。本发明描述的方法可以使用DNA样品，RNA靶，或混合DNA/ RNA群体的靶标。在另外的实施方案中，公开的方法可以使用PCR和/或逆转录聚合酶链反 应（RT-PCR)用于扩增多核苷酸。
[0024] 在一个实施方案中，包括用鉴定标签标记的靶序列的产物的扩增可以使用如在 W0/2009/124293中描述的扩增子拯救多重聚合酶链反应，和使用W0/2010/132834中描述 的方法和装置来完成，其内容以其整体通过引用并入本文。简言之，使用高浓度、靶特异性 嵌套引物进行靶特异性第一扩增步骤。例如靶特异性引物可以用于扩增一种或多种（并且 优选多种）细菌、病毒、真菌和/或其它来源的靶核酸。靶核酸可以是人或动物来源。在 一个实施方案中，所述靶核酸来源于人临床样品。如在图1中说明的，正向引物匕连接于 另外的核苷酸或用另外的核苷酸"标记"以提供不特异性于靶核酸的另外的序列，从而用此 中引物扩增靶核酸B还将把图1中作为"索引序列"的非干扰性、非消除性靶特异性多核苷 酸鉴定标签整合入产生的扩增子。在一个实施方案中，所述非干扰性、非消除性靶特异性 多核苷酸鉴定标签选自表1中列出的那些。所述方法整合另外的引物FC和F。，其功能在 W0/2009/124293中详细描述。扩增进行，反应终止，并