水稻温敏叶色突变基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程领域。具体地说，本发明涉及一种水稻温敏叶色突变基 因及其应用。
【背景技术】
[0002] 在植物基因工程中，需要用到筛选标记以方便筛选转化子，随着转基因植物的商 品化，其安全性问题也逐渐引起了人们的高度重视，其中主要涉及筛选标记的安全性。目 前，植物基因工程中使用的筛选标记主要是编码抗生素抗性或除草剂抗性蛋白的基因，但 这些基因存在安全性方面的问题。为了提高转基因植物的安全性，人们开始寻找生物安全 的筛选标记。使用生物安全标记基因不必担心由于"基因逃逸"而产生的应用生素失效，产 生"超级杂草"，破坏生态平衡等问题，从而避免了由于使用抗生素或抗除草剂标记基因而 引起的争议。
[0003]安全标记基因主要包括化合物解毒酶基因和糖类代谢酶基因两类。近几年，随着 对生物代谢机理研究的不断深入，人们发现许多代谢过程中的关键酶基因可用作转基因植 物的筛选标记，且由于它源于生物体内固有的代谢途径，属于绿色筛选标记。
[0004] 水稻叶色突变体具有稳定，易于识别等优点，已被广泛应用于形态标记、品种改良 等多个领域。而温敏感叶绿素缺失突变体是一类比较特殊的叶色突变体，在限制温度以下， 突变体往往表现出突变表型（如白化、斑叶等），改变温度到适宜温度时，叶片的表型可以 恢复至绿色，与野生型植株表型一致。而温敏感叶色突变体在一些植物中有报道，如拟南 芥、烟草、日本柳杉等。然而，这些温敏叶色相关基因大多不适合作为筛选标记。
[0005] 同时，叶绿素合成是一个复杂的生物化学反应，被子植物中一共包含16步反应， 在拟南芥和水稻中相关基因已经被克隆。温敏感叶绿素缺失突变体的特殊性和复杂性就在 于受环境温度的影响而出现不同的表型，这一特征跟许多全生育期叶绿素缺失的突变体差 异很大。植物体内存在一种或多种感知温度的转录因子，被环境温度激活后催化相应的基 因表达，从而使植物适应环境温度。温敏叶绿素缺失突变体可能是一些在一定温度下表达 的基因突变导致叶绿素合成通路中断，从而产生突变表型；当温度改变时，这些基因的作用 被其他途径所取代，植物就恢复正常的表型。
[0006] 到目前为止，人们虽然已经报道和克隆了一些受温度调控的基因，但是受调控的 机制依然没有阐明。
[0007] 本领域迫切需要开发一种安全的、操作简便的、可广泛用于转基因植物简便筛选 和良性育种等领域的温敏叶色性状相关基因工程选择标记。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的就是提供一种优异、安全、操作性强且用法便捷的基因工程选择标 记。
[0009] 在本发明的第一方面，提供了一种TCD5多肽或其编码基因的用途，所述多肽或其 编码基因用于调节或提供植物的温敏叶色性状，或被用作转基因植物的选择标记。
[0010] 在另一优选例中，所述的选择标记的标记性状为温敏叶色变异。
[0011] 在另一优选例中，所述的温敏叶色变异指在低温（低于25°c，较佳地< 20°C，如 15-20°C )，叶片或叶片的一部分（如叶尖）表现为白色；在高温条件下（高于28°C，较佳地 彡30°C，如30-35°C )时，叶片表现为绿色。
[0012] 在另一优选例中，所述的T⑶5多肽或其编码基因来自水稻。
[0013] 在另一优选例中，所述的T⑶5多肽选自下组：
[0014] 优选地，所述的T⑶5多肽任选自下组：
[0015] ⑴具有SEQ ID N0. : 2所示氨基酸序列的多肽；
[0016] (ii)将如SEQ ID N0. :2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺 失或添加而形成的，具有提供温敏叶色的功能、由（i)衍生的多肽；或
[0017] (iii)氨基酸序列与SEQ ID N0. :2所示氨基酸序列的同源性彡95%(较佳地 彡98%，更佳地彡99%)，具有提供温敏叶色的功能的多肽；
[0018] 较佳地，所述的T⑶5多肽的编码基因选自下组：
[0019] (A)编码如SEQ ID N0. : 2所示多肽的多核苷酸；
[0020] ⑶序列如SEQ ID N0. : 1所示的多核苷酸；
[0021] (C)核苷酸序列与SEQ ID N0. : 1所示序列的同源性彡95% (较佳地彡98%，更佳地 > 99%)的多核苷酸；
[0022] (D)在SEQ ID N0. : 1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60个（较 佳地1-30,更佳地1-10个）核苷酸的多核苷酸；
[0023] (E)与（A)_⑶任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
[0024] 在另一优选例中，所述的TCD5多肽是无单加氧酶活性的突变型蛋白。
[0025] 在另一优选例中，所述的突变型蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0. :4所示。
[0026] 在另一优选例中，所述的TCD5多肽的编码基因编码无单加氧酶活性的突变型 TCD5蛋白。
[0027] 在另一优选例中，所述突变型T⑶5多肽的编码基因是序列如SEQ ID N0. :3所示。
[0028] 在本发明的第二方面，提供了一种调节植物温敏叶色的方法，包括步骤：降低所述 植物中TCD5多肽或其编码基因的表达或活性。
[0029] 在本发明的一个优选例中，所述植物为水稻。
[0030] 在本发明的一个优选例中，所述方法包括敲除TCD5基因、或使TCD5蛋白失活，从 而降低TCD5多肽或其编码基因的表达或活性。
[0031] 在另一优选例中，所述的降低是通过敲除所述植物中的TCD5基因实现的。
[0032] 在另一优选例中，所述的降低是通过向所述植物中转入干扰野生型T⑶5基因表 达的抑制剂实现的。
[0033] 在另一优选例中，所述的抑制剂包括miRNA或表达miRNA的载体。
[0034] 在另一优选例中，所述方法包括步骤：
[0035] (a)提供携带反义表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有反义表达TCD5多肽编 码基因的多核苷酸序列；
[0036](b)将植物细胞或组织或器官与步骤（a)中的农杆菌接触，从而使反义表达TCD5 多肽编码基因的多核苷酸序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；
[0037] (c)选择已转入反义表达TCD5多肽编码基因的多核苷酸序列的植物细胞或组织 或器官；
[0038] (d)将步骤（c)中的植物细胞或组织或器官再生为植株。
[0039] 在本发明的一个优选例中，所述方法包括：
[0040] (i)提供一植物或植物细胞，其中所述植物或植物细胞的染色体不含编码具有单 加氧酶活性的TCD5编码基因；
[0041] (ii)将编码突变型TCD5多肽的编码基因，导入所述植物或植物细胞，从而获得转 基因的植物或植物细胞。
[0042] 在另一优选例中，所述的突变型TCD5多肽是无单加氧酶活性的。
[0043] 在本发明的第三方面，提供了一种TCD5基因或其TCD5多肽在筛选调节水稻的温 敏叶色性状的促进剂或拮抗剂中的应用。
[0044] 在本发明的第四方面，提供了一种筛选调节温敏叶色性状的促进剂或拮抗剂的方 法，所述方法包括以下步骤：
[0045] (a)在测试组中，在待测物质存在下，培养水稻细胞或水稻，并测定所述水稻细胞 或水稻中T⑶5多肽的表达量和/或活性，其中表达量记为E1，活性大小记为A1 ;
[0046] 并且，在对照组中，在与测试组相同的但无待测物质存在的条件下，培养相同类型 的水稻细胞或水稻，并测定所述水稻细胞或水稻中TCD5多肽的表达量和/或活性，其中表 达量记为E0,活性大小记为A0 ;
[0047] (b)比较测试组和对照组中T⑶5多肽的表达量和/或活性，
[0048] 其中，如果E1显著高于E0和/或A1显著高于A0,则提示所述待测物质是抑制温 敏叶色性状的抑制剂；
[0049] 如果E1显著小于E0和/或A1显著小于A0,则提示所述待测物质是促进温敏叶色 性状的促进剂。
[0050] 在另一优选例中，所述的"显著高于"指E1/E0彡2 ;或A1/A0彡2。
[0051] 在另一优选例中，所述的"显著低于"指E1/E0彡0. 5 ;或A1/A0彡0. 5。
[0052] 在本发明的第五方面，提供了一种挑选转入外源基因的转基因植物的方法，包括 步骤：
[0053] (1)提供一转基因构建物，所述构建物包括待转入的外源基因以及标记基因，其中 所述的标记基因编码无单加氧酶活性的突变型TCD5蛋白；
[0054] (2)将所述的转基因构建物导入一植物细胞，并获得转基因的所述植物细胞；
[0055] (3)培养步骤⑵获得的植物细胞，从而获得转基因的植物；
[0056] (4)观察所述转基因植物的温敏叶色性状，挑选出具有温敏叶色性状的植株，作为 转入外源基因的转基因植物；和
[0057] (5)任选地，测定步骤⑷中所述转基因植物中所述外源基因的表达情况。
[0058] 在另一优选例中，所述的植物细胞为水稻细胞。
[0059] 在另一优选例中，所述的植物细胞的染色体不含编码具有单加氧酶活性的TCD5 编码基因。
[0060] 在本发明的第六方面，提供了一种突变型TCD5多肽，所述的突变型TCD5不具有单 加氧酶活性；较佳地，所述的突变型蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. :4所示。
[0061] 在本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸序列，所述的多核苷酸序列编码本发 明第六方面所述的突变型TCD5多肽。
[0062] 在另一优选例中，所述的多核苷酸序列如SEQIDN0. :3所示。
[0063] 在本发明的第八方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第七方面所述的多 核苷酸序列。
[0064] 在本发明的第九方面，提供了一种细胞，所述的细胞含有本发明第八方面所述的 载体，或其染色体中整合有外源的本发明第七方面所述的多核苷酸序列。
[0065] 在另一优选例中，所述的细胞包括农杆菌细胞、植物细胞。较佳地，所述植物细胞 为水稻细胞。
[0066] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一赘述。
【附图说明】
[0067] 图1显示了嘉花1号（左）和突变体mr40(右）在不同温度下的叶色比较。其中， 左图为将两者于低温20°C中培养的情况；中图为将两者于高温30°C培养的情况；右图为将 两者于中间温度24°C培养的情况。