解淀粉芽孢杆菌植物亚种zfh-3及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于水果保鲜、采后病害防治领域，涉及一种解淀粉芽孢杆菌植物亚种 ZFH-3及其应用，尤其是在水果如柑橘、香蕉、草莓采后主要病害防治与保鲜中的应用。
【背景技术】
[0002] 水果采后病害是影响水果产业健康发展的主要因素，也是水果采后贮运研宄的重 点。柑桔米后病害主要有青霉病、绿霉病、蒂腐病、酸腐病和炭疽病。香蕉米后病害主要是 轴腐病（冠腐病）、炭疽病，草莓采后不耐贮，易腐烂，主要是灰霉病、软腐病。大部分的水果 采后病害为侵染性病害，大多从脐部、蒂部和伤口入侵，并可通过病果接触交叉传染，造成 采后果实在贮运期内的腐烂变质，失去食用价值，腐烂率一般为10 %~30 %，会造成严重 的经济损失。
[0003] 为提高水果采后病害防治技术水平、减少化学杀菌剂使用、减少环境污染、降低抗 药性，保证食品安全，开发有效、安全、生态的生物防治保鲜产品具有重要意义。
[0004] 我国水果采后病害的生物防治研宄起步较晚、基础较差，现有的研宄也大部分还 是基础理论研宄，从生防菌筛选鉴定、果蔬适应性、生物防治机理、基因诱变改进等方面进 行了系列研宄与报道，应用性研宄较少，较少能实现产业化。另一方面，我国在水果采前的 生物防治的基础理论及应用研宄较深入，发酵工艺、产品生产等工业化条件较成熟，已有产 业化产品，为采后生物防治技术的产业化提供了可能。
[0005] 解淀粉芽孢杆菌是重要的植物病害拮抗菌，普遍存在于土壤、果蔬与植物的表面 及组织内，是动植物的有益菌，生态、环保，对人无毒、安全，较多研宄及专利报道了其在农 作物病害、土壤微生物及促植物生长、土壤肥力改良，水产养殖等方面的应用，应用范围广、 生长适应性强，易在任何介质定殖、繁殖，易大量培养、生产工艺简单，产业化可行性高。
[0006] 目前解淀粉芽孢杆菌用于采后病害生物防治报道较少，更未有市场化的果蔬采后 病害生物防治解淀粉芽胞杆菌类产品，为此开发含解淀粉芽孢杆菌用于水果采后病害防治 保鲜的生物产品具重要意义。
【发明内容】
[0007] 本发明的第一个目的在于提供一种可有效防治水果采后病害的生物防治菌。
[0008] 本发明的上述发明目的是通过以下技术方案达到的：
[0009] 一种解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3菌株，该亚种菌株的分类命名为解淀粉芽孢 杆菌植物亚种（Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarum)，其保藏编号为：CGMCC No. 9884,保藏日为2014年10月30日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所。
[0010] 本发明的第二个发明目的是提供一种上述解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3原粉 的制备方法。
[0011] 本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
[0012] 一种解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3原粉的制备方法，包括如下步骤：
[0013] (1)、活化菌种
[0014] 活化解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3菌株，待解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3在 LB固体培养基上的菌落乳白色，圆形，明显突起，表面光滑，不透明，边缘整齐；
[0015] (2)、一级种子液的制备
[0016] 选取LB固体培养基上的单菌落，接种于一级种子摇瓶中，将一级种子摇瓶在 32°C、180r/min下培养14小时，得到一级种子液；
[0017] (3)、二级种子液的制备
[0018] 种子罐中的培养基仍为LB液体培养基，121°C下，灭菌20min，将一级种子液接入 种子罐中培养，培养结束时得到二级种子液；
[0019](4)、解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3菌液发酵
[0020] 将步骤⑶所得解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3的二级种子液，按照接种量为1 % 接入发酵罐中，在发酵培养基下培养，得到发酵成熟菌剂（主要为芽孢）；
[0021] (5)、解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3菌原粉
[0022] 步骤（4)所得的发酵成熟菌剂经碟片离心机或微滤设备浓缩后，加入轻质碳酸 钙，浓缩成熟菌剂与轻质碳酸钙的重量比为100:3,得到液固混合物，将该液固混合物搅拌 30min后，利用输料泵将液固混合物送入离心式喷雾塔中干燥，得到解淀粉芽孢杆菌植物亚 种ZH1-3原粉。
[0023] 所述步骤⑴中所述LB培养基配方（g/L):蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，溶 剂为水，pH7. 0-7. 2,固体培养基在液体培养基中加2%琼脂；
[0024] 所述步骤⑶中所述种子罐的接种量为0. 5-1% (V/V);培养条件为：通气比1 :1， 搅拌转速为250-400r/min，培养温度32°C，罐压0. 05Mpa，培养12小时；所述二级种子液的 活菌含量为1-3X108cfu/mL，0D值 0.85 ;
[0025]所述步骤⑷中所述发酵培养基的配方（重量百分比）：玉米淀粉3%，豆柏 粉3 %，酵母膏0. 9 %，氯化钠0. 25 %，碳酸钙0. 25 %，硫酸镁0. 4 %，磷酸氢二钾0. 3 %， pH7. 2-7. 5，121°C灭菌30min;培养条件为：通气比为1 :0. 7,搅拌转速为180r/min、罐压 0. 05MPa、培养温度32°C、培养时间为48h，发酵过程中根据泡沫情况流加消泡剂；下罐时间 以取样镜检芽孢90%以上释放为准，成熟发酵液中解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3活芽孢 含量为 30 ~40X108cfu/mL;
[0026] 所述步骤（5)中所述离心式喷雾塔的干燥条件为：进风口温度为180_200°C，出风 口温度为80-85°C，菌原粉中含水量小于5% (W/W)，活芽孢含量2000X108cfu/g。
[0027] 本发明所述的可有效防治水果采后贮藏病害的物质主要指解淀粉芽孢杆菌植物 亚种ZFH-3菌株本身及其产生的所有物质。
[0028] 本发明的第三个目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3在防治水果 米后病害中的应用。
[0029]本发明的上述发明目的是通过以下技术方案达到的：
[0030] 一种解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3在防治水果采后病害中的应用。
[0031] 其中，所述病害为青霉病、绿霉病、蒂腐病、酸腐病、炭疽病，炭疽病、轴腐病，灰霉 病或软腐病。
[0032] 其中，所述水果为柑桔，所述病害为柑桔青霉病、柑桔绿霉病、柑桔酸腐病、柑桔炭 疽病或柑桔蒂腐病。
[0033] 其中，所述水果为香蕉，所述病害为香蕉炭疽病或轴腐病。
[0034] 其中，所述水果为草莓，所述病害为草莓灰霉病或软腐病。
[0035] 本发明具有下列优点和效果：
[0036] 解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3是珠海真绿色技术有限公司从食用真菌根部分 离筛选到的对多种植物病原菌具抑菌作用的菌株，通过获得的16SrDNA和gyrB基因片段， 在NCBI上BLAST搜索和比对，并结合菌的形态、生理生化，判定为一新的解淀粉芽孢杆菌植 物亚种菌株，并于2014年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，保藏编号为CGMCCNo. 9884。
[0037] 本发明的解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3是从食用真菌类根中部分离筛选到的 对多种植物病原菌具抑菌作用的生防菌，取自自然。解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3是动 植物的有益菌，较多研宄及专利已报道了其在农作物病害、土壤微生物及促植物生长、土壤 肥力改良，水产养殖等方面的应用，生态、环保，对人无毒、安全，应用范围广、生长适应性 强，在任何介质都易于定殖、繁殖，易大量培养、生产工艺简单，产业化可行性高。关于在 农产品采后病害防治即采后水果保鲜应用研宄报道较少，鉴于解淀粉芽孢杆菌植物亚种 ZFH-3对水果采后病害的有效抑制作用，对人无毒、有利于环境，安全、生态、环保等优点，用 于水果采后病害防治，能减少化学药剂保鲜带来的食品安全、药物残留、环境污染等问题， 减少化学药剂使用量，确保食品安全、环境友好、生态安全。
[0038] 下面通过附图和【具体实施方式】对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保 护范围的限制。
[0039] 保藏信息：
[0040] 解淀粉芽孢杆菌植物亚种ZFH-3菌株，该菌株的分类命名为解淀粉芽孢杆菌植物 亚种（Bacillusamyloliquefacienssubsp.plant