体外诱导胚胎干细胞分化为红系细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于再生医学和生物技术领域，涉及红系细胞的制备方法，尤其是一种体外诱导胚胎干细胞向红系细胞分化的方法。
【背景技术】
[0002]随着我国医疗技术的快速发展和人们生活要求的日益增高，成分输血在临床医疗实践中不断深入，其中红系细胞(也称血细胞)的用量最大。红系细胞输注已是现代医疗技术中至关重要的细胞治疗手段，目的主要是改善患者的缺氧状态，广泛应用于术后及外伤、慢性贫血及其他多种疾病的治疗。但目前临床上仍然依赖志愿者无偿献血这一途径为主要血液来源，血液供应非常紧张，血液供应不足的报道经常见于报纸、电视和网络等各种媒体。目前随着检测技术的不断改进，输血引起的传染病发生率已经非常低，但是仍时有发生。这些问题对临床输血应用的安全性和广泛性带来了严峻的挑战，因此寻找更为安全和经济的血液来源一直是输血医学研宄的重要方向，人们将目光投向了体外生产红系细胞，红系细胞的体外制备可按需要生产特定血型，并可最大限度地避免输血相关传染疾病的发生等。
[0003]目前已开发了多种红系细胞代用品，主要包括血红蛋白氧载体和氟碳类化合物两大类。然而血红蛋白氧载体稳定性差、纯化困难、工艺复杂而且成本高，氟碳类化合物携氧能力弱，代谢慢，并且有很大的毒副作用，因此这两类红系细胞替代品尚不能大规模的应用，需要继续寻找新的血液红系细胞替代来源。近年来干细胞及其应用已成为世界生命科学研宄的热点之一，以干细胞为技术平台的相关研宄在细胞治疗、胚胎发育、新基因的功能研宄、基因治疗、药物筛选和新药药理研宄等领域都显现出诱人的应用前景。
[0004]干细胞在体外具有自我更新和多向分化能力，其独有的特性:1)高度的自我更新能力，在体外具有接近无限的增殖能力；2)发育分化的全能性；3)遗传的可操作性，使得其作为体外诱导分化的种子细胞具有明显的优势。以人胚胎干细胞体外定向分化为基础的细胞治疗可能为很多疾病的治疗带来希望，其中将人胚胎干细胞在体外大规模诱导分化为成熟红细胞可作为新的血液替代来源有可能为解决目前临床输血治疗面临的问题带来希望，将具有广泛的应用前景和重大的社会经济效益。
[0005]目前，体外诱导人胚胎干细胞分化为成熟红系细胞并最终应用于临床还有很多关键的技术问题需要解决，包括如何安全低成本的由人胚胎干细胞向造血干细胞分化，如何高效率诱导造血干细胞向红系细胞分化，如何保证诱导分化成熟的红系细胞是否能够在体内发挥功能，诱导获得红细胞的安全性和免疫排斥等问题。在以上问题中，本发明首次建立以胚胎干细胞为启动细胞定向诱导生成红系细胞的体外制备方法，拟通过解决其中两个关键性技术问题，即在体外实现安全低成本的由人胚胎干细胞向造血干细胞分化和体外无血清培养体系下高效率的由造血干细胞定向分化为红系细胞。希望通过解决以上两个关键技术问题使人胚胎干细胞向成熟红细胞分化能够更安全、高效，为最终为由胚胎干细胞获得满足临床输血需要的红系细胞进行技术储备。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是，提供一种取材方便、易于体外扩增、免疫源性低的体外诱导胚胎干细胞向红系细胞分化的方法。
[0007]为了解决上述技术问题，达到上述技术效果，本发明采用以下技术方案实现:
本发明的体外诱导胚胎干细胞分化为红系细胞的方法，采用含有地塞米松的诱导体系对胚胎干细胞进行预诱导，进而采用含有无血清培养添加剂N2或B27、前列腺素E2和L-谷氨酰胺的无血清培养基体系诱导培养，然后采用含有干细胞因子(SCF)、白介素3、促红细胞生成素的无血清培养基体系诱导分化成红系细胞。
[0008]本发明方法分化的红系细胞是一种用于失血、缺血、体液丧失，需要及时补充人体所必需的胶体溶液的来源，由人胚胎干细胞在体外定向分化形成，并可通过静脉输注的方法替代血液制品。
[0009]本发明方法分化形成的红系细胞表面标记物⑶36阳性表达率为90%以上。
[0010]进一步的，所述的体外诱导胚胎干细胞分化为红系细胞的方法，其特征是由下述步骤组成:
(1)胚胎干细胞体外常规培养；
(2)胚胎干细胞的预诱导:采用由添加了0.1mM地塞米松的含双抗的DMEM/F-12完全培养基制备而成的诱导体系I培养；
(3)预诱导的细胞定向分化成造血干细胞:采用包括体积比例浓度为2%的N2或B27、含双抗的无血清StemSpan ? ACF培养基，并添加了 20ng/ml前列腺素E2、2mM的L-谷氨酰胺制备而成诱导体系II培养；
(4)造血干细胞定向分化成红系细胞:采用包括体积比例浓度为2%的N2或B27、含双抗的的无血清StemSpan ? ACF培养基，并添加了 0.1mM干细胞因子(SCF)、0.15mM白介素3,0.05mM促红细胞生成素制备而成的诱导体系III培养。
[0011]进一步的，所述的步骤(I)具体包括以下步骤:常规培养胚胎干细胞进行传代和扩增，此阶段培养基为:85%DMEM培养基为基础培养基，添加15% Knockout SerumReplacement，lmmol/L必需氨基酸，100IU/mL青霉素，50 μ g/mL链霉素和4ng/mL碱性成纤维细胞生长因子。细胞培养在37°C，5%的二氧化碳条件下孵化，每周传代一次。
[0012]进一步的，所述的步骤(2)具体包括以下步骤:为了诱导人胚胎干细胞向造血细胞的分化，在培养6?7天对胚胎干细胞进行诱导。用lmg/mL IV型胶原酶在37°C下消化3?5min吹打成小细胞团，然后使用超低黏附6孔培养板悬浮7天，第I?5天采用含体积比例浓度为100IU/mL青霉素，50 μ g/mL链霉素的DMEM/F-12完全培养液培养，每2天换液一次，在培养的第5天采用添加预诱导因子0.1mM地塞米松的诱导体系I培养2?3天，置于37 °C，5% 二氧化碳培养箱中培养。
[0013]进一步的，所述的步骤(3)具体包括以下步骤:将上述步骤(2)预诱导培养的细胞移至0.1%明胶包被的96孔组织培养板。采用诱导体系II，可避免因添加血清而可能带来的异源污染，置37°C，5% 二氧化碳培养箱中培养6?8天，每2天补液一次?’每7天换液一次，贴壁培养后，每天在光学显微镜下观察培养皿中细胞生长情况，培养20天后获得由胚胎干细胞定向分化成的造血干细胞。
[0014]进一步的，所述的步骤(4)具体包括以下步骤:
第一步，将上述步骤(3)制备干细胞进行经流式检测，⑶34阳性细胞比例为90%以上，满足下一步对其进行扩增培养的要求；
第二步，通过免疫磁珠法成功分离出CD34阳性细胞接种于培养皿中进行培养，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液1.0ml，浸入覆盖瓶底，倒置显微镜下观察见细胞呈圆形漂起时，加入1.0ml胎牛血清中止消化；
第三步，加入1ml PBS反复吹打冲洗，在室温下900转/分离心10分钟；弃去上清液后，加入1ml无血清诱导体系III重悬细胞，重新接种在培养皿中；
第四步，将上述培养皿置37°C，5% 二氧化碳培养箱中培养6?8天，每3天补液一次；每7天换液一次，培养20天后获得由造血干细定向分化而来的红系细胞，收集红系细胞并进行流式检测，结果显示⑶36阳性表达率为90%以上。
[0015]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
本发明诱导方法首次实现体外由胚胎干细胞诱导生成造血干细胞，继而在进行又到生成红系细胞。通过本发明方法制备的造血干细胞和红系细胞特异表达性高，造血干细胞⑶34阳性表达率由现有技术的85%提升到90%，红系细胞⑶36阳性表达率由现有技术的86%提升到90%以上；且首次建立以胚胎干细胞为启动细胞定向诱导生成红系细胞的体外制备方法，具有较强的创造性。
[0016]本发明方法进一步提供了充足、安全、有效和经济的细胞来源，更有利于扩大血液输注应用；且中间诱导生成的造血干细胞同样具有向红细胞和血小板细胞分化的能力，对于血液疾病如白血病的治疗也提供了一种新的造血干细胞的来源；诱导使用的干细来源于胚胎干细胞，取材方便、易于体外扩增、免疫原性低。由于生理学特点基本一致，所以无论何种来源的人类干细胞，都适用本发明所提供的诱导方法。
【附图说明】
[0017]此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1是体外诱导胚胎干细胞分化为红系细胞的技术方案实施流程图；
图2是加不同浓度的前列腺素E2和L-谷氨酰胺培养造血红细