一种EphrinB2高表达的重组HEK293细胞及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及EphrinB2高表达的非癌细胞的构建，特别涉及一 种基于外源重组质粒的EphrinB2高表达的重组HEK293细胞及其应用。
【背景技术】
[0002] 酪氨酸激酶受体（RTK)是一个庞大的家族，在生物体的生命活动中担当着非常重 要的作用。RTK的胞外区是结合配体结构域，配体是可溶性或膜结合的多肽或蛋白类激素， 包括胰岛素和多种生长因子。胞内段是酪氨酸蛋白激酶的催化部位，并具有自磷酸化位点。 当配体与RTK结合后，能诱导受体构象变化，导致受体发生稳定的二聚化，二聚化的受体发 生磷酸化，在受体激酶区内形成含有磷酸化酪氨酸位点的基序，并伴有PTK的激活。酪氨酸 特异的磷酸化使激酶区稳定在激活的构象，并为下游含有src癌基因家族SH2区和结合磷 酸化酪氨酸的功能区（phosphotyrosinebindingdomain,PTB)的信号转导分子提供识别、 停靠和结合的部位。PTK通过启动细胞内的信号通路调节细胞的生长、分化、运动、变形和代 谢等，导致多种效应。
[0003]Eph是属于目前已知最大的蛋白酪氨酸激酶受体家族（RTKs)亚族，包括Eph受体 及其Ephrin配体。EphB4与EphrinB2在信号传递时表现出独特的方式，可互被对方激活， 产生"正向信号"和"反向信号"，以EphrinB2激活EphB4等信号通路为正向信号；而EphB4 激活EphrinB2为反向信号。EphB4/EphrinB2及其独特的双向信号转导几乎参与血管生长 的每个方面。EphrinB2可能在VEGF信号通路中扮演一个总调控者的角色，并在血管生长中 发挥核心作用。Eph/Ephrin家族是受体酪氨酸激酶家族中的最大亚族，根据配体结构不同 分为两种亚型：固定于胞膜上的称为EphrinA亚型，共5种；而3种B亚型的Ephrin配体则 属于跨膜蛋白（Cell，1997, 90(3) :403-404)。根据同源序列将Eph受体也分为两组：EphA 和EphB受体。Eph受体由跨膜域、细胞外配体识别域和半胱氨酸域组成，半胱氨酸域中含 有一个位于细胞内侧的PDZ结合域；Eph跨膜蛋白位于细胞外负责识别细胞环境中信号的 结构域可以与Ephrin发生作用，形成多聚体的形式，因而导致Ephrin配体和Eph受体的活 化，从而影响细胞相互作用及细胞迀移等功能（CurOpiniCellBio, 2010, 22:611-616)。 [0004] 肿瘤的发生、发展和转移依赖于肿瘤血管形成，只有在新生血管形成以后，肿瘤才 能迅速生长，并进一步向周围浸润和进入血液循环向远处转移，而Eph/Ephrin信号转导是 胚胎生长、血管生长和发生过程的重要细胞形态学调控因素，Eph/Ephrin家族中的数个配 体和受体已经证实参与了肿瘤生长过程（CancerCell, 2010, 17:533-534)。
[0005] 创新药物研宄与开发是国家科技计划中的重大研宄领域，抗肿瘤药物靶向筛选是 新药筛选的一个重要方向和领域。目前，寻找靶标开发抗肿瘤药物己成为治疗恶性肿瘤生 长和转移的重要手段之一。在肿瘤细胞抑制剂的研发中，尚没有对EphrinB2有一定的抑制 作用药物。以EphrinB2为祀点，寻找祀向于肿瘤中EphrinB2的药物会成为研发抗肿瘤药 物的重要途径之一。目前对EphrinB2基因的研宄较多，但对全长序列EphrinB2载体的构 建及生物学应用研宄及其应用未见报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种EphrinB2高表达的重组HEK293细胞及其应用，在构 建EphrinB2全长基因的表达载体的基础上，转染HEK293细胞，获得稳定、高表达EphrinB2 分子的重组HEK293细胞株，能够用于以EphrinB2为靶点的药物的筛选。
[0007] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0008] 一种EphrinB2高表达的重组HEK293细胞，该重组细胞是以HEK293细胞为宿主细 胞，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含EphrinB2全长基因的表达载体。
[0009] 所述的EphrinB2全长基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO. 1所示。
[0010] 所述的包含EphrinB2全长基因的表达载体是pEZ-M61-EphrinB2,其中 pEZ-M61-EphrinB2是将EphrinB2全长基因克隆到载体pEZ-M61中。
[0011] 所述的pEZ-M61-EphrinB2的引物序列为：
[0012] 上游引物：5-TCATCTTCATCGTCATCATCATC-3
[0013] 下游引物：5-CTGTCCGCAGTCCTTAGC_3。
[0014] EphrinB2高表达的重组HEK293细胞在以EphrinB2为靶点的药物筛选中的应用。
[0015] 所述的以EphrinB2为祀点的药物为能够与受体EphB4-Fc结合的药物。
[0016] 相对于现有技术，本发明的有益效果为：
[0017] 1、本发明提供了一种EphrinB2高表达的重组细胞，在构建EphrinB2全长基因 的表达载体的基础上，转染HEK293细胞，获得稳定、高表达EphrinB2分子的重组HEK293 细胞。与现有只含EphrinB2胞外区或部分基因序列构建的重组细胞相比，本发明构建的 包含EphrinB2基因全长的重组HEK293细胞膜能够稳定的表达EphrinB2分子，最高表达 EphrinB2受体量较转染前提高29. 3倍，而且具有完整的分子活性。
[0018] 2、作为宿主细胞的HEK293细胞为原代人胚肾细胞转染5型腺病毒（Ad5)DNA的永 生化细胞，该细胞本身含有的各种受体表达量相对较低；而本发明提供的重组J1EK293细胞 的EphrinB2配体的相对表达量比HEK293明显增高，相对于其他细胞表面分子占据表达优 势地位，在结合其受体方面处于有利地位；这样就大大提高了筛选以EphrinB2为靶点药物 的灵敏性及特异性；同时能够为进一步研宄EphrinB2生物学特性以及发现功能蛋白的有 效性提供较好的细胞模型。
[0019] 3、在肿瘤细胞抑制剂的研发中，尚没有靶向于EphrinB2的药物。因此运用构建的 重组HEK293细胞对上市的索拉菲尼和达沙替尼药物进行了细胞抑制试验，发现在一定浓 度下达沙替尼对重组HEK293细胞有良好的抑制作用，表明本发明提供的重组HEK293细胞 可以应用以EphrinB2为靶点的药物筛选。
【附图说明】
[0020] 图1是pEZ-M61-EphrinB2载体的质粒图谱；
[0021] 图2是DMEM培养基加G418筛选阳性细胞的培养图；其中a是对照组HEK293细 胞，b是重组HEK293细胞，c是重组HEK293细胞的荧光图；
[0022] 图3是重组HEK293细胞的EphrinB2表达水平的RT-PCR检测图；其中1为重组 HEK293细胞，2为转染空质粒的HEK293细胞，3为未转染的对照组HEK293细胞；
[0023] 图4是重组HEK293细胞经提取RNA、反转录和PCR后琼脂糖凝胶电泳图；其中泳 道1为Marker，泳道2为转染pEZ-M61-EphrinB2的重组HEK293细胞，泳道3为未转染的 HEK293细胞，泳道4为转染空载体的HEK293细胞；
[0024] 图5是在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白定性鉴定EphrinB2在重组HEK293 细胞中的表达图；其中a为对照组HEK293细胞，b为重组HEK293细胞；
[0025] 图6是重组HEK293细胞与EphrinB2的受体EphB4的结合图；
[0026] 图7是WesternBlot检测重组HEK293细胞的EphrinB2表达量图；其中1为重组 HEK293细胞，2为转染空质粒的HEK293细胞，3为未转染的HEK293细胞；
[0027] 图8是MTT实验检测达沙替尼对重组HEK293细胞的抑制作用并绘制的量效曲线 图。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合附图对本发明做进一步详细说明。
[0029] 本发明首先构建了EphrinB2全长基因的真核表达载体pEZ-M61-EphrinB2,其基 因测序结果与基因库人EphrinB2-致，pEZ-M61-EphrinB2载体脂质体法转染HEK293细胞， 经过筛选获得了稳定、高表达EphrinB2分子的重组HEK293细胞，即重组HEK293-EphrinB2 细胞。下面对本方面做详细说明是对本发明的解释而不是限定。
[0030]a?本发明是以pEZ-M61_EphrinB2为基础载体（GeneCopoeia公司），引物序列如 下：
[0031] 上游引物：5-TCATCTTCATCGTCATCATCATC-3
[0032]