检测K-ras基因突变的探针、引物、试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，应用于生物科学研宄和临床分子诊断，具体涉及一种 检测K-ras基因第13位密码子突变的探针、引物、试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] K-ras基因（GenBank:NC_000012)突变在多种癌症中都有表达，如胰腺癌、结肠 癌、血癌、甲状腺癌、胆管癌、肺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、皮肤癌、精原细胞癌等，其中，K-ras 基因突变尤其在胰腺癌及结肠癌的发生发展中起重要作用。已有文献报道，在胰腺癌组织、 胰液或粪便、血液中、结肠癌组织中可检测出K-ras基因第12、13或61密码子点突变。研宄 表明，检测体细胞DNA中K-ras基因突变与否，可作为胰腺癌早期诊断的一种方法。95%的 胰腺癌患者组织中存在K-ras基因突变，被认为是胰腺癌的早期事件，在一些实验中发现 慢性胰腺炎、胆道结石及表面健康正常人等人群中也存在K-ras基因突变，通过单纯的定 性分析，敏感性较差，无法区分疾病人群，定量分析能更好反映突变程度，以便于良恶性鉴 另IJ。目前临床应用较多的K-ras基因突变检测方法为限制性片断长度多态性分析法（RFLP 法）、扩增受阻突变体系法（ARMS法）和高分辨率熔解曲线法（HRM)。
[0003] RFLP法：原理是将PCR与限制性酶切相结合的方法。第一步PCR 引物（K1-上游：5 ' -CTGAA TATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT-3 ' 与 K2-下 游：5' -TCAAAGAATGGTCCTGGACC-3')通过单一碱基错配，在K-ras基因第12密码子上游 引入BstNI酶切位点，第一步PCR反应中野生型与突变型基因同比扩增，之后内切酶BstNI 破坏了野生型片断，在第二步PCR时主要就只能扩增突变型基因片断，使突变型基因片断 "信号放大"，从而提高了检测基因突变的敏感性。该方法的缺点是：1.步骤烦琐，耗时费 力，需要2天时间才能完成鉴定；2.这种方法只能作定性研宄，只能明确是否存在K-ras 基因突变，无法实现定量检测；3.存在第一轮酶切不完全及开放操作导致的假阳性；4.检 测灵敏度有限，无法实现较低含量的检测（参见文献Watanabe H，et al. Detection of K-ras point mutations at codon 12in pure pancreatic juice for the diagnosis of pancreatic cancer by PCR-RFLP analysis, Pancreas 1996 ;12:18 - 24)〇
[0004] ARMS法：原理是根据3'端错配原则，在进行扩增反应时，若3'端碱基对形成 错配，链延伸反应就会因3'，5'二磷酸二酯键形成的障碍而受阻，因此，只有模板链是 特定的等位基因时，才会检测出特异的扩增产物。在ARMS的反应体系中，引物上标记2 个不同荧光素，或加入荧光探针等方法都是以实时荧光PCR为基础的基因分型方法。该 方法的缺点是：1.每种特异性引物或探针只能针对某一种基因突变类型进行鉴定，而 K-ras基因在第12、13密码子的突变类型可有十余种，需要逐一检测；2.可能出现由于 单一碱基错配造成的假阳性；3.无法避免引物错配导致的假阳性结果出现（参见文献 Fox JC，et al. The detection of K-ras mutations in colorectal cancer using the amplification-refractory mutation system, Br J Cancer 1998 ;77:1267-74)〇
[0005] HRM法：本原理是根据不同核酸分子的GC含量、GC分布及碱基互补性差异，双链 DNA分子在加热变性时会有自己熔解曲线的形状和位置，其极高的温度均一性和温度分辨 率使分辨精度高，依据高性能荧光染料释放荧光信号，进而实现达到对单个碱基差异的区 分。在SNP的检测中，SNP位点由于不匹配双链DNA在升温过程中会先解开，荧光染料从 局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不 同SNP位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能够有效区分不同SNP 位点与不同基因型。HRM检测不受突变碱基位点和种类的局限，可以对未知突变、已知突 变进行筛查、扫描，亦可用于短片段重复序列的分析。该方法缺点是必须依赖高精度PCR 仪（LightCycler 480 和 Rotor-Gene 6000)和饱和性染料（LC Green、Eva Green 等），同 时其检测灵敏度为3%，无法检出更低量的突变，使其应用受到限制（Soulieres D，Greer W，Magiiocco A M，Huntsman D，Young S，Tsao M S，et al. KRAS mutation testing in the treatment of metastatic colorectal cancer with anti-EGFR therapies[J].Curr Oncol，2010, 17Suppl 1:S31-S40)。
[0006] 肽核酸（PNA)是一类人工合成的、结构上类似于DNA及RNA的核酸类似物，呈 电中性，其骨架由2 -氨乙基甘氨酸取代了 DNA的磷酸二酯糖，能侵入DNA双链形成稳 定的PNA-DNA双螺旋而不发生静电排斥，因此可以用来抑制野生型K-ras基因的扩增 反应。其较之传统DNA探针具有不少优点：1. PNA-DNA结合十分稳定，正确配对的DNA/ PNA的稳定性远远高于相应的DNA/DNA，同时在PCR反应过程中PNA亦不会被其他酶所 降解。2.对于错配的PNA/DNA，一个碱基的错配能造成其融解温度下降9-10°C左右。目 前，肽核酸作为一种分子生物学工具已在疾病的诊断、治疗等领域得到应用（参见文 献：张兵波等，PNA探针与DNA探针的系统比较A Systemic Comparison between PNA Probe and DNA Probe，《高分子通报》2006 ;9 :62_68 ;Egholm M，et al. PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the ffatson-Crick hydrogen-bonding rules，Nature, 1993, 365:566 ~568) 〇
【发明内容】
[0007] 本发明要解决目前检测K-ras基因突变的方法存在不能同时定性和定量、操作繁 琐、灵敏度低的技术问题，提供一种检测K-ras基因第13位密码子突变的探针、引物、试剂 盒及方法，该方法通过一次PCR反应就能确定K-ras基因第13位密码子突变类型和突变 量，且操作简便、灵敏度高。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
[0009] 在本发明的一个方面，提供了一种检测K-ras基因突变的探针，该探针是与K-ras 基因第13位密码子的突变型序列特异性结合的Taqman MGB荧光探针，所述K-ras基因第 13位密码子的突变型选自：AGC、CGC、TGC、GAC、GCC、GTC。
[0010] Taqman探针只与模板特异性结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5'端标 记有报告基团（Reporter, R)，如FAM、VIC等，3'端标记有淬灭基团（Quencher, Q)，如TAMRA 等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。 随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到模板结合的探针，其3' 一5'外切核酸酶活性 就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经 过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度就 代表了模板DNA的拷贝数。
[0011] Taqman MGB荧光探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，本身不产生荧光，可以大 大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团，可以 将探针的Tm值提高10°C左右。因此，为了获得同样的Tm值，Taqman MGB探针可以比普通 的Taqman探针设计得更短。
[0012] 优选的，本发明探针包括SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3所示序列的探针，其中，SEQ ID N0:2探针是和K-ras基因第13位密码子AGC、CGC、TGC三种突变类型（即13密码子第 1个碱基突变）特异性结合的兼并探针，SEQ ID NO:3探针是和K-ras基因第13位密码子 GAC、GCC、GTC三种突变类型（即13密码子第2个碱基突变）特异性结合的兼并探针，该 SEQ ID NO: 2探针上标记的荧光与SEQ ID NO: 3探针上标记的荧光不同，在本发明的一个实 施例中，3￡〇10勵:2探针两端分别标记报告基团？411及淬灭基团1?迅，5￡〇10勵 :3探针 两端分别标记报告基团VIC及淬灭基团MGB。
[0013] 在本发明的另一方面，还提供了一种检测K-ras基因突变的引物，所述引物用于 扩增包含K-ras基因第13位密码子的核苷酸序列，该引物包括SEQIDN0:4和SEQIDN0:5 所示序列的引物对。
[0014] 在本发明的另一方面，还提供了一种检测K-ras基因突变的试剂盒，所述试剂盒 包括：
[0015] 与K-ras基因第13位密码子突变型序列特异性结合的Taqman MGB荧光探针，所 述1(-四8基因第13位密码子的突变型选自46(：、06(：、16(：、6六(：、6〇：、61'(： ;
[0016] 用于扩增包含K-ras基因第13位密码子的核苷酸序列的引物对；
[0017] 针对野生型K-ras基因第13位密码子GGC设计的PNA。
[0018] 优选的，所述试剂盒包括：
[0019] SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3 所示序列的探针；
[0020] SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5 所示序列的引物对；
[0021] SEQ ID NO: 1 所示序列的 PNA。
[0022] 优选的，所述试剂盒