一种苹果干细胞的培养方法及培养的苹果干细胞的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物干细胞培养技术领域，尤其涉及一种苹果干细胞的培养方法及培 养的苹果干细胞。
【背景技术】
[0002] 植物干细胞（plantstemcell)是未分化的细胞，具有很强的自我更新和持续分 裂能力。植物干细胞培养技术，是在传统组培技术的基础上，以植物干细胞为目标，诱导、分 离和培养外植体，建立相应的干细胞培养体系植物干细胞培养技术，不仅丰富了植物培养 技术，而且为天然产物的商业化生产，乃至植物生物技术的发展，提供了新的研宄方向和契 机。
[0003] 根据目标干细胞的不同，目前较为成功的植物干细胞培养方法主要分为三种：木 本植物维管束形成层分生（例如：红豆杉干细胞）、草本植物储藏根的维管形成层（例如： 人参干细胞）、静止中心（例如：水稻干细胞、苹果果实干细胞）。
[0004] 现有的苹果果实干细胞由瑞士米百乐生化公司以成熟的瑞士苹果 UttwilerSpiitlauber果实为基础研制，并将其制成脂质体用于美容产品，能够具有延 缓衰老和去皱的能力。因此，添加有苹果果实干细胞的美容产品十分畅销，往往面临 供不应求的问题。这主要是因为苹果果实干细胞的产量较低。宄其原因，一方面由于 UttwilerSpiUlauber苹果品种种质过于稀少，原料的稀少造成苹果果实干细胞产量无法 得到提高。另一方面，苹果果实细胞属于静止中心，已处于分化末端，将其去分化而获得干 细胞的难度较高，不仅需要较强诱导条件以使苹果果实细胞去分化，在培养过程中往往需 要更长的周期和更多的去分化培养次数，这是造成苹果果实干细胞产量得不到提高的根本 原因。
[0005] 并且，虽然将苹果果实干细胞制成脂质体能够使皮肤更容易吸收，以便将其做成 美容产品。但脂质体的添加无疑会导致活性物质浓度的降低的提取，且脂质体的制备方法 较为复杂，再次延长了干细胞的制备周期。并且，脂质体对胃肠道内环境大多十分敏感，将 其用于口服容易导致活性物质的降解或生物利用度的降低。
[0006]因此，提供一种能够快速制备苹果干细胞的方法进而提供一种活性成分含量较高 的且适合口服的苹果干细胞十分必要。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种制备苹果干细胞的方法，本发 明提供的方法能够快速且大量的制备苹果干细胞，进而提供一种活性成分含量较高的且适 合口服的苹果干细胞提取物。
[0008] 本发明提供的培养苹果干细胞的方法，包括以下步骤：
[0009] 步骤1:苹果新生枝条杀菌、去除木质部和髓后，接种于诱导培养基，诱导培养获 得形成层细胞；
[0010] 步骤2 :形成层细胞经继代培养，接入增殖培养基，摇床培养获得单细胞；
[0011] 步骤3 :将单细胞接种于增殖培养基经扩大培养，获得苹果干细胞；
[0012] 诱导培养基为含有NAA、BA和水解酪蛋白的MS固体培养基；
[0013] 增殖培养基为含有2, 4-D、BA、水解酪蛋白和活性炭的MS液体培养基。
[0014] 本发明选择苹果新生枝条作为原料进行诱导制备苹果干细胞。苹果为蔷薇科苹果 属植物，其枝条由叶芽发展而来，纵切面由外之内分别为表皮、皮质、韧皮部、形成层、木质 部和髓。其中，形成层位于韧皮部与木质部之间，是一种分生组织，起源于未分化，但保持胚 性的增生和分化能力的细胞。愈伤组织内也可形成形成层。相对于果实而言，枝条的细胞 更为原始，而果实的细胞处于分化的末端。苹果新生枝条指形成时间在一年以内的枝条，而 多数苹果品种的新梢在年周期中都有两次生长，分别为春梢或秋梢。本发明采用的苹果品 种为富士苹果（MaluspumilaMil)，其在国内种植广泛，原料来源广泛。
[0015] 在本发明的实施例中，杀菌包括以下步骤：
[0016] 步骤1 :将苹果新生枝条以水冲洗后，以浓度为10~1000mg/L的L-抗坏血酸溶 液浸泡；
[0017] 步骤2 :以体积分数为60 %~95 %的乙醇水溶液浸泡后以无菌水冲洗；
[0018] 步骤3 :以体积分数为10%~100%的过氧化氢水溶液浸泡后以无菌水冲洗。
[0019] 作为优选，苹果新生枝条的长度为10cm。
[0020] 作为优选，L-抗坏血酸的浓度为120mg/L。
[0021] 作为优选，步骤1中所述浸泡的时间为0. 5min~lOmin。
[0022] 优选的，步骤1中所述浸泡的时间为lmin。
[0023] 作为优选，乙醇水溶液中乙醇的体积分数为75%。
[0024] 作为优选，步骤2中所述浸泡的时间为0.lmin~lOmin。
[0025] 优选的，步骤2中所述浸泡的时间为lmin。
[0026] 作为优选，步骤2中无菌水的体积为2L。
[0027] 作为优选，过氧化氢水溶液中过氧化氢的体积分数为30%。
[0028] 作为优选，步骤3中所述浸泡的时间为lmin~50min。
[0029] 优选的，步骤3中所述浸泡的时间为20min。
[0030] 作为优选，步骤3中所述冲洗的时间为lmin~50min。
[0031] 优选的，步骤3中所述冲洗的时间为10min。
[0032] 以本发明提供的杀菌方法对苹果新生枝条进行杀菌能够充分的杀除苹果新生枝 条上所携带的真菌、细菌或病毒。以便保证苹果新生枝条在培养过程中不被干扰，从而保证 苹果新生枝条上的细胞更加快速的去分化。而实验表明，本发明提供的方法能够有效将苹 果新生枝条细胞去分化，经诱导和扩大培养，48天左右即可获得大量的苹果干细胞。
[0033] 本发明提供方法采用的诱导培养基为含有NAA、BA和水解酪蛋白的MS固体培养 基。MS培养基是一种常用的植物培养基，可用于诱导愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花 药的培养。NAA是萘乙酸的简称，是一种常见的植物生长素、能促进细胞的分裂与扩大。BA 为苄氨基腺嘌呤的缩写，是一种细胞分裂素，6-BA比较常见。水解酪蛋白（CH)对细胞的增 殖有明显的促进作用。本发明通过实验证明，植物激素的种类、用量和比例对苹果干细胞的 去分化诱导起着至关重要的作用。当采用NAA、BA和水解酪蛋白对苹果枝条进行诱导时，能 够快速的获得去分化的形成层细胞，将这些去分化的形成层细胞经扩增后即可获得大量的 苹果干细胞。
[0034] 在本发明实施例中，NAA、BA和水解酪蛋白的质量比为（0. 1~10) :(0. 1~10): (0? 1 ~10)〇
[0035] 在本发明实施例中，NAA、BA和水解酪蛋白的质量比为0.5 :2 :1。
[0036] 作为优选，诱导培养基中NAA的浓度为0.lmg/L~10mg/L。
[0037] 优选的，诱导培养基中NAA的浓度为0.5mg/L。
[0038] 作为优选，诱导培养基中BA的浓度为0.lmg/L~10mg/L。
[0039] 优选的，诱导培养基中BA的浓度为2.Omg/L。
[0040] 作为优选，诱导培养基中水解酪蛋白的浓度为0.lmg/L~10mg/L。
[0041] 优选的，诱导培养基中水解酪蛋白的浓度为1.Omg/L。
[0042] 作为优选，诱导培养基为固体培养基，其中琼脂的质量分数为1%。
[0043] 作为优选，诱导培养基的pH值为6. 0。
[0044] 在本发明的实施例中，步骤1中所述的接种为，每g去除木质部和髓的苹果新生枝 条接种于l〇cm2的诱导培养基。
[0045] 本发明实施例中，诱导培养为暗培养；温度为10°C~30°C;时间为1天~20天。
[0046] 在一些实施例中，诱导培养为暗培养；温度为25°C;时间为10天。
[0047] 经诱导培养后，形成层组织为均一生长的平板状组织，而其他组织则为不规则的 聚集生长物。
[0048] 本发明的实施例中，继代培养为暗培养；温度为10°C~30°C;时间为1天~20天。
[0049] 在一些实施例中，继代培养为暗培养；温度为25°C;时间为10天。
[0050] 在本发明的实施例中，继代培养采用遇到培养基，每lg形成层细胞接种于10cm2 的诱导培养基。
[0051] 经10天的继代培养，形成层细胞形成愈伤组织，每10cm2的诱导培养基上约有愈 伤组织20. 8g。
[0052] 本发明提供的增殖培养基为含有2, 4-D、BA、水解酪蛋白和活性炭的MS液体培养 基。2, 4-D即2，4-二氯苯氧乙酸，是一种植物生长素，对不同植物细胞而