一株产l-赖氨酸的菌株及其生产l-赖氨酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株产L-赖氨酸的菌株及其生产L-赖氨酸 的方法。
【背景技术】
[0002] L-赖氨酸（L-Lysine，Lys)是生物体维持生命活动的必需氨基酸之一，是世界上 仅次于味精的第二大氨基酸品种，也是生物基尼龙等新型材料的重要前体。L-赖氨酸的生 产方法包括抽提法、化学合成/酶法和微生物发酵法。微生物发酵法是目前工业生产赖氨 酸的最重要方法，发酵原料广泛易得且价格便宜，如淀粉（木薯淀粉、玉米淀粉等）、糖蜜 (甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜等）。
[0003] 微生物发酵法是通过代谢控制发酵，人为地控制或改变微生物的代谢途径来实现 L-赖氨酸的生产。离子束生物工程技术作为一种全新的诱变育种技术已广泛地应用于生物 诱变育种方面。低能氮离子作用于微生物时，能够使微生物细胞壁/膜的结构及通透性改 变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代谢网络显著变化，最终导致微生物产生 突变。此诱变技术已分别应用于谷氨酸、L-乳酸等生产菌株选育，使得谷氨酸、L-乳酸分别 提尚 35%、46%。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一目的是提供了一种能够简单、高效、安全生产L-赖氨酸的菌株。
[0005] 本发明第二目的是提供一种上述菌株的获取方法。
[0006] 本发明第三目的是提供一种利用上述菌株生产L-赖氨酸的方法。
[0007] 为了实现本发明的第一目的，本发明采用的技术方案如下：
[0008] 一种生产L-赖氨酸的菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌ZY0217 (Escherichia coli ZY0217)，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO :M 2015079。
[0009] 本发明菌株的形态学及生理生化特征如下：
[0010] 菌落颜色：灰白色。
[0011] 需氧方式：好氧生长。
[0012] 菌落大小：0· 2 ~0· 9X 1 ~5 μπι。
[0013] 适宜生长温度：34-40°C。
[0014] 适宜生长 pH :6. 5-7. 2。
[0015] 菌体形态：圆形菌落，有金属光泽。
[0016] 革兰氏染色：阴性。
[0017] 上述大肠埃希氏菌ZY0217的获取方法，是以E. coli A301为出发菌株，通过紫 外-氯化锂复合诱变，低能离子注入诱变，初、复筛而得到。
[0018] 具体地说，所述大肠埃希氏菌ZY0217的获取方法包括如下步骤：
[0019] 1)菌悬液制备
[0020] E. coli A301与添加氯化锂的无菌水混合制成菌悬液，细菌浓度为IO6个/mL ; [0021 ] 2)紫外-氯化锂复合诱变
[0022] 将步骤1)的菌悬液转入含有磁力转子的无菌空平板中，在搅拌速率50-100rpm 下，进行紫外照射诱变，后取菌悬液涂布于添加氯化锂的LB平板培养基中，在34-40°C下避 光倒置培养l-2d ;
[0023] 3)低能离子注入诱变
[0024] 将步骤2)中培养后的菌株洗涤，并制成菌悬液涂布于无菌空平皿上，吹干后，进 行氮离子注入，后洗脱、涂布到LB平板培养基上，在34-40°C下避光倒置培养l-2d ;
[0025] 4)初筛
[0026] 挑取步骤3)培养得到的单菌落，接种至斜面培养基上活化，在34-40?下倒置培 养l-2d后，移至种子培养基中搅拌培养7-10h ;
[0027] 将若干培养好的菌落按一定接种量分别接种到IL发酵罐中，同时通入空气，搅拌 发酵24-62h，检测发酵液中L-赖氨酸含量，初筛出L-赖氨酸含量大于65g/L的菌落；
[0028] 发酵过程中，采用氨水、2mol/L盐酸控制发酵液pH ;
[0029] 5)复筛
[0030] 将步骤4)初筛得到的单菌落接种至斜面培养基上活化，在34-40?下倒置培养 l-2d后，移至种子培养基中搅拌培养7-10h ;
[0031] 将若干培养好的菌落按一定接种量分别接种到5L发酵罐中，同时通入空气，搅拌 发酵48-120h ;检测发酵液中L-赖氨酸含量，筛选出L-赖氨酸产量高的菌落；
[0032] 重复步骤1)至步骤5)，最终筛选出发酵液中L-赖氨酸含量为70g/L及以上的目 标菌株大肠杆菌ZY0217。
[0033] 上述大肠杆菌ZY0217的获取方法中，所述步骤1)中氯化锂的添加量为无菌水质 量的2-4%，优选2.5% ;
[0034] 所述步骤2)中氯化锂的添加量为LB平板培养基质量的2-4%，优选2. 5% ;所述 紫外照射条件：30W紫外灯；照射距离25cm ;照射时间10-90s，优选30s ;
[0035] 所述步骤3)中低能氮离子注入条件：2-4Kv/cmX2-5min(在电场强度为2-4Kv/cm 的条件下，诱变 2-5min)，优选为：4Kv/cmX3min ;注入剂量为 15X1014-20X1014ions/cm2; 优选 15X 1014ions/cm2〇
[0036] 所述步骤4)和5)中，种子培养中搅拌速度为150-250rpm ;接种量为1-5% (v/v); 发酵中搅拌速度为200-900rpm。
[0037] 本发明中，所述LB培养基，包含如下质量百分数组分：胰蛋白胨1%、酵母提取物 0.5%、氯化钠1%，其余为水，pH 6. 8-7. 2。
[0038] 所述种子培养基包含如下质量百分数组分：碳源0. 1% -0. 2%、氮源3% -8%、无 机盐0.5% -1.3%，其余为水，pH 6.8-7. 2 ;其中，所述碳源为葡萄糖和/或蔗糖；所述氮 源为蛋白胨、酵母提取物或硫酸铵中的一种或几种混合；所述无机盐为钾盐、镁盐、铁盐、锰 盐、钠盐或钙盐中的一种或几种混合；优选种子培养基，由如下质量百分数组分组成：葡萄 糖0.05%、蔗糖0.15%、蛋白胨3%、酵母提取物3 %、硫酸铵2 %、磷酸氢二钾0. 3 %、硫酸 镁0. 1 %、硫酸亚铁0. 05%、硫酸锰0. 03%、磷酸二氢钠0. 25%、碳酸钙0. 17%，其余为水， pH 6. 8-7. 2。
[0039] 所述发酵罐中的发酵培养基包含如下质量百分数组分：
[0040] 碳源 1.0% -2 %，氮源 0.5 % -2 %，无机盐 0· 1% -1 %，其余为水，pH 6.8-7.2 ;其 中，所述碳源为葡萄糖和/或蔗糖；所述氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、酵母提取物或 硫酸铵中的一种或几种混合；所述无机盐为钾盐、镁盐、铁盐、锰盐、钠盐或钙盐中的一种或 几种混合。
[0041] 优选发酵培养基，由如下质量百分数组分组成：葡萄糖0. 5%、蔗糖0. 3%、玉米 浆0. 4 %、花生饼粉0. 4 %、黄豆饼粉0. 4 %、硫酸铵0. 2 %、磷酸氢二钾0. 08 %、硫酸镁 0. 02 %、硫酸亚铁0. 04%、硫酸锰0. 05 %、磷酸二氢钠0. 15 %、碳酸钙0. 13 %，其余为水，pH 6. 8-7. 2。发酵过程采用氨水、2mol/L盐酸控制发酵液pH。
[0042] 一种利用大肠杆菌ZY0217生产L-赖氨酸的方法，包括如下步骤：
[0043] 1)斜面培养
[0044] 将ZY0217接种于斜面培养基中，培养温度34-40°C，培养时间l-2d ;
[0045] 2)种子培养
[0046] 将步骤1)斜面培养的菌株ZY0217接种于种子培养基中，培养温度为34-40°C，搅 拌培养7-1 Oh ;
[0047] 3)发酵培养
[0048] 将步骤2)培养后的菌株ZY0217接种到发酵培养基中，培养温度为34-40°C ;同时 通入空气，搅拌发酵24-62h。
[0049] 在利用菌株ZY0217生产L-赖氨酸的方法中，所述斜面培养基为LB培养基，具体 配方同上。
[0050] 所述步骤2)中，搅拌速度为150-250rpm ;种子培养基配方同上。
[0051] 所述步骤3)中，搅拌速度为200-900rpm ;接种量为1-5% (v/v);发酵培养基配方 同上。
[0052] 作为本发明大肠杆菌ZY0217生产L-赖氨酸的一个优选实施方式，所述斜面培养 基的配方：LB培养基，质量百分数组分为：胰蛋白胨1%、酵母提取物0. 5%、氯化钠1%，其 余为水，pH 6. 8-7. 2 ;
[0053] 所述种子培养基的配方：蔗糖0. 2%、蛋白胨2%、硫酸铵2%、酵母提取物1 %、磷 酸氢二钾0. 4 %、硫酸镁0. 3 %、硫酸亚铁0. 02 %、硫酸锰0. 07 %，其余为水，pH 6. 8-7. 2 ;
[0054] 所述发酵培养基的配方：
[0055] 葡萄糖1. 5 %、玉米浆0. 5 %、硫酸铵0. 5 %、磷酸氢二钾0. 05 %、硫酸锰0. 02%、硫 酸亚铁0. 04%、硫酸镁0. 05%，其余为水，pH 6. 8-7. 2。
[0056] 本发明有益效果：
[0057] 本发明采用将低能氮离子注入和紫外-氯化锂复合诱变相结合，最终筛选获得一 株生产L-赖氨酸的大肠杆菌ZY0217,菌株连续传代7次后发酵液中L-赖氨酸含量为70g/ L左右，无显著变化，遗传稳定性好；利用该菌株生产L-赖氨酸，可较大幅度提高发酵产物 中L-赖氨酸含量。
【附图说明】
[0058] 图1为大肠杆菌ZY0217的诱变筛选流程图