禽和猪戊型肝炎病毒共有抗原、单克隆抗体和制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及两个禽和猪戊型肝炎病毒共有抗原表位的氨基酸序列，及能够识别上 述共有抗原表位的单克隆抗体，还涉及该表位的模拟肽和单抗在体外检测中的应用，属于 生物学领域。
【背景技术】
[0002] 戊型肝炎是由戊型肝炎病毒Ofepatitis E virus，HEV)感染所致的急性病毒性肝 炎，主要流行于亚洲、非洲和拉丁美洲等发展中国家，在发达国家也偶有病例报道。在我国 发生的急性病毒性肝炎中戊型肝炎约占20%左右。越来越多的研宄发现戊型肝炎是一种人 畜共患疾病，因此该病是一个重要的公共卫生问题。
[0003] 已有研宄发现，HEV可以感染猪、鸡、羊、鼠和牛等动物。Meng等于1997年分离鉴 定了第一个动物HEV分离株--猪HEV，并且发现其与人HEV的同源性达到了 97 %左右，而 且越来越多的证据证明，猪HEV具有人畜共患性。2001年，Haqshenas等从患有肝炎脾肿大 Ofepatitis-splenomegaly，HS)综合症的鸡胆汁中分离出第二个动物分离株--禽HEV。 目前虽然还没有直接证据表明禽HEV可以感染人类，但抗禽HEV的特异性抗体在人和猪血 清中的检出，说明禽HEV具有感染人类或其它家畜的可能性。
[0004] 禽与猪HEV在遗传性和抗原性上具有相关性。基因序列分析发现，禽与猪HEV的 全基因组均含有3个开放阅读框（ORF)，0RF1、0RF2和0RF3。其中，0RF2编码病毒的衣壳 蛋白，是病毒主要的结构蛋白，并含有病毒主要的抗原表位。相关的研宄在分析禽HEV的衣 壳蛋白抗原性发现，该蛋白C端的268个氨基酸区域能够与人和猪HEV的抗血清发生交叉 反应，说明该区域含有禽和猪HEV的共有抗原表位。但是关于共有抗原表位的精确鉴定，及 该共有抗原表位的模拟肽在禽和猪HEV的血清学诊断应用却仍没见有相关报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一提供两株能够分泌抗禽和猪戊型肝炎病毒共有抗原表位的单 克隆抗体杂交瘤细胞株。
[0006] 本发明的目的之二在于提供两个禽和猪戊型肝炎病毒共有抗原表位的氨基酸序 列。
[0007] 本发明的目的之三在于依据上述氨基酸序列设计合成了两个用于禽和猪戊型肝 炎抗体检测的多肽，并依据该多肽建立禽和猪戊型肝炎病毒感染的血清学诊断方法。
[0008] 本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：
[0009] 作为本发明的第一方面，禽和猪HEV衣壳蛋白共有抗原表位的氨基酸序列为V/ IPHD(SEQ ID No:l)和 VKLYM(SEQ ID No:2)。
[0010] 作为本发明的二方面，一种蛋白，名称为单克隆抗体3E8(单抗3E8)，是识别共有 抗原表位，禽和猪HEV 0RF2蛋白的序列I/VPHD(SEQ ID N〇:l)的特异性抗体，其杂交瘤细 胞株细胞保藏号为CCTCC N〇:C201395。
[0011] 进一步鉴定发现，所述表位的模拟肽的氨基酸序列为VPHD(SEQ ID No: 1)。其中 V和D中的一个或多个氨基酸进行缺失或替换，会影响多肽与单抗的结合力，但是不影响结 合，而氨基酸P和H是关键氨基酸，影响单抗与多肽的结合。
[0012] 作为本发明的第三方面，一种蛋白，名称为单克隆抗体1B5(单抗1B5)，是识别共 有抗原表位，禽和猪HEV 0RF2蛋白的序列VKLYM(SEQ ID No: 2)的特异性抗体，其杂交瘤细 胞株的细胞保藏号为CCTCC N〇:C201396。
[0013] 进一步，发现每个氨基酸序列均影响着单抗与多肽的结合。
[0014] 作为本发明的第四方面，制备两株分泌抗禽和猪HEV衣壳蛋白共有抗原表位的单 克隆杂交瘤细胞系。
[0015] 一种单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0016] 其特征在于，包括以下步骤：
[0017] 利用禽戊型肝炎病毒中国分离株（Hepatitis E virus, HEV, CaHEV, Genbank number GU954430)的0RF2蛋白为免疫原，免疫BABL/c小鼠，采用杂交瘤细胞技术制备了两 株分泌抗禽和猪HEV共有抗原表位单克隆抗体的杂交瘤细胞系，分别命名为3E8和1B5。
[0018] 进一步，两个共有抗原表位的单抗隆抗体3E8和1B5,重链均为IgGl，轻链均为κ 链。
[0019] 作为本发明的第五方面，一种共有抗原表位制备的多肽，其特征在于，用于制备禽 和猪戊型肝炎疫苗。一种上述的共有抗原表位制备的多肽及应用，利用两个表位的氨基酸 序列合成多肽为包被抗原，间接ELISA发现其能与禽和猪HEV的阳性血清发生强烈的抗原 抗体反应，而与阴性血清不反应。
[0020] 作为本发明的第六方面，所述单克隆抗体用于制备在禽和猪戊型肝炎病毒诊断中 的应用试剂盒。
[0021] 本发明技术方案的详细描述：
[0022] 本发明用纯化的原核表达的禽戊型肝炎病毒中国分离株（Hepatitis E virus, HEV, CaHEV, Genbank number ⑶954430) 0RF2 的 C 端 268 个氨基酸蛋白为免疫原，免 疫BALB/c鼠，制备抗禽戊型肝炎病毒中国分离株（Hepatitis E virus, HEV, CaHEV, Genbank number GU954430) 0RF2蛋白的单克隆抗体，成功制备了两株单克隆抗体3E8和1B5。 并且通过间接ELISA和Western blotting方法检测发现，该两株单抗除能特异性 与禽HEV 0RF2蛋白反应外，还能与猪戊型肝炎病毒中国山东分离株Ofepatitis E virus, HEV，CHN-SD-sHEV, Genbank number KF176351)0RF2 蛋白发生交叉免疫反应，表明 3E8和1B5识别的表位为禽和猪HEV 0RF2蛋白共有抗原表位。
[0023] 利用3E8和1B5两株单抗，包被ELISA反应板，然后利用噬菌体展示随机环7肽库 试剂盒（BioLabs @inc)分别筛选上述两个单抗识别的模拟表位，发现一个表位基序I/VPHD 与单抗3E8具有结合活性，另一个表位基序VLYMSV与单抗1B5具有结合活性。
[0024] 本发明的有益效果：
[0025] 本发明的禽和猪戊型肝炎病毒衣壳蛋白两个共有抗原表位的模拟肽。
[0026] -种单克隆抗体3E8所识别的共有抗原表位，其氨基酸序列是由禽和猪HEV 0RF2 蛋白的序列I/VPHD(SEQ ID No:l)组成。
[0027] -种单克隆抗体1B5所识别的共有抗原表位，其氨基酸序列是由禽和猪HEV 0RF2 蛋白的序列VKLYM(SEQ ID No:2)组成。
[0028] 该共有抗原表位可以用于禽和猪戊肝的快速诊断以及疾病流行的监控。用于制备 禽和猪戊型肝炎疫苗，纯度大于98%。
[0029] 本发明的两株识别上述共有抗原表位的单克隆抗体，可以快速诊断禽和猪戊型肝 炎病毒。
【附图说明】
[0030] 图1目的基因重组表达质粒的酶切鉴定。
[0031] 图2A目的蛋白纯化的SDS-PAGE分析（A)。
[0032] 图2B目的蛋白纯化的Western blot鉴定（B)。
[0033] 图3纯化的单抗3E8和1B5的抗体效价。
[0034] 图4两株单抗3E8和1B5与禽和猪HEV 0RF2蛋白的ELISA交叉反应结果，Avian HEV是禽戊肝病毒，Swine HEV为猪戊肝病毒。
[0035] 图5A单抗3E8与禽和猪HEV 0RF2蛋白的Western blot的交叉反应结果。
[0036] 图5B单抗1B5与禽和猪HEV 0RF2蛋白的Western blot的交叉反应结果。
[0037] 图6A单抗3E8筛选阳性噬菌体的ELISA检测验证。
[0038] 图6B单抗1B5筛选阳性噬菌体的ELISA检测验证。
[0039] 图7模拟共有抗原表位及突变和缺失的多肽与单抗3E8和1B5的ELISA反应结果。
[0040] 杂交瘤细胞株3E8【禽戊型肝炎病毒中国分离株（Hepatitis E virus, HEV, CaHEV, Genbank number ⑶954430)0RF2 蛋白的单克隆抗体 3E8】
[0041] 保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心（CCTCC)
[0042] 地址：湖北省武汉市武汉大学
[0043] 保藏日期：2013年7月17日
[0044] 保藏编号：CCTCC NO:C2Ol395。
[0045] 杂交瘤细胞株1B5【禽戊型肝炎病毒中国分离株（Hepatitis E virus, HEV, CaHEV, Genbank number ⑶954430)0RF2 蛋白的单克隆抗体 1B5】
[0046] 保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心（CCTCC)
[0047] 地址：湖北省武汉市武汉大学
[0048] 保藏日期：2013年7月17日
[0049] 保藏编号：CCTCC NO:C2Ol396。
【具体实施方式】
[0050] 以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。
[0051] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实 验室手册》（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件或厂 商提供的条件进行。
[0052] 实施例1小鼠免疫与单克隆抗体的制备
[0053] (1)表达、纯化禽HEV 0RF2蛋白C端268个氨基酸
[0054] 根据禽戊型肝炎病毒中国分离株（Hepatitis E virus, HEV, CaHEV, Genbank number⑶954430)，设计带有BamHI和XholI酶切位点的引物0RF2-268-F: CACGGATCCCAGTATATGTACGGC(SEQ ID No:3) ；0RF2-268-R ：GAACTCGAGTTAGGGTGGTGAGGGGAA T(SEQ ID N〇:4)，以CaHEV悬液为模板，RT-PCR方法得到目的基因序列，然后将目的基因 与pET-28a(+)载体同时用BamHI和XholI进行双酶切，T4连接酶连接，构建重组表达质粒 PET-0RF2-268。重组质粒经酶切鉴定后得到了目的基因片段