一种通过回接分离获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于病原菌的分离鉴定领域，特别涉及一种通过回接分离获得万寿菊黑斑 病病原菌单孢系的方法。
【背景技术】
[0002] 万寿菊（TageteserectaL.)为菊科（Compusitae)万寿菊属（Tagetes) -年生 草本植物，不仅可用于城市的园林美化，同时也是提取天然叶黄素的重要原料。随着种植面 积的不断推广和扩大，万寿菊黑斑病害的发生日益严重，特别是气候异常年份如连阴雨天 或高温干旱等。北京延庆地区大面积种植的色素万寿菊，2010年和2011年两年病害的严重 发生已成为其发展的一个限制因素。在发展万寿菊的生产中，病害已成了重要的限制因素 之一。
[0003]目前对万寿菊黑斑病原菌的鉴定多采用传统分类鉴定方法，因形态、地域的差 异，结论并不一致。我国有一些文献上对万寿菊黑斑病有过报道，他们都用了不同的种 名：如高洁（高洁，白庆荣，董然，等.2002.万寿菊细菌性叶斑病的发生与病原菌鉴定 [J].吉林农业大学学报，24(2) :94-96,107)等通过形态学、生理生化性状及生态学特 征将万寿菊细菌性叶斑病的致病菌确定为丁香假单胞菌万寿菊致病变种（Pseudomonas syringaepv.tagetes);王龙等则将甘肃地区万寿菊叶斑病的病原鉴定为链格孢属 (Alternariasp.)物种；王婦等通过形态鉴定将万寿菊叶斑病的病原菌鉴定为细极链格孢 (A.tenuissima)〇
[0004] 上述方法所需的时间较长，操作繁琐，得到一批菌系（7~9个单孢系）需要半年。 并且，传统分类鉴定方法在分离病原菌的时候往往无法有效地剔除腐生菌，准确性有限，导 致不同人的鉴定结果不同。因此，目前的科研和实践中需要一种操作简便、时间短、准确性 高的万寿菊黑斑病病原菌单孢系的分离方法。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种通过回接分离获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] -种通过回接分离获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法，包括以下步骤：
[0008] 病残植株采集步骤：
[0009] 采集田间的万寿菊黑斑病的病残植株；
[0010] 孢子悬液配制步骤：
[0011] 取所述病残植株的茎段上的黑霉，配制成孢子悬液；
[0012] 回接步骤：
[0013] 将所述孢子悬液接种于万寿菊幼苗，得到自然发病的植株；
[0014] 寄生菌分离步骤：
[0015] 选取生长于所述自然发病的植株的带有病斑的部分，消毒后培养得到疑似寄生菌 的菌落；
[0016] 产孢步骤：
[0017] 将所述疑似寄生菌的菌落进行扩繁，诱发产生孢子；再将所述孢子接种于万寿菊 幼苗验证寄生性，选取有寄生性的菌株；
[0018] 单孢系分离步骤：
[0019] 将所述有寄生性的菌株进行单孢系分离处理，得到黑斑病病原菌单孢系。
[0020] 上述方法的优选的实施方式中，所述病残植株采集步骤中，还将所述病残植株进 行保湿处理。
[0021] 上述方法的优选的实施方式中，所述保湿处理为：将所述病残植株在清水中浸泡 3-6小时，优选为4小时，再放入湿度为100 %的密闭空间里保湿40-60小时，优选为48小 时。
[0022] 上述方法的优选的实施方式中，所述孢子悬液配制步骤中，所述孢子悬液的孢子 浓度为5000-15000个孢子/毫升，优选为10000个孢子/毫升。
[0023] 上述方法的优选的实施方式中，所述回接步骤中，所述接种为：将喷洒有所述孢子 悬液的万寿菊幼苗置于封闭的保湿容器中，所述保湿容器内的空气湿度为100%。
[0024] 上述方法的优选的实施方式中，所述回接步骤中，所述保湿容器中装有40-60°C， 优选为50°C的水；优选地，所述回接步骤中，所述保湿容器中水面的高度达到装有万寿菊 幼苗的容器的高度的0. 3-0. 8,进一步优选为0. 6。
[0025] 上述方法的优选的实施方式中，所述寄生菌分离步骤中，采用PDA培养基；所述 PDA培养基中，PDA培养基粉末的浓度为30-50g/L，进一步优选为39g/L。
[0026] 上述方法的优选的实施方式中，所述产孢步骤中，采用玉米培养基；所述玉米培养 基中，玉米培养基粉末的浓度为70-80g/L，进一步优选为75g/L。
[0027] 上述方法的优选的实施方式中，所述单孢系分离步骤中，所述单孢系分离处理为： 取所述有寄生性的菌株的产生孢子，涂布于水琼脂培养基上，观察后挑取孢子；再将挑取的 孢子于PDA培养基上培养5-8天，得到所述单孢系。
[0028] 上述方法的优选的实施方式中，所述单孢系分离步骤中，水琼脂培养基中，琼脂粉 浓度为20-40g/L，进一步优选为30g/L。
[0029] 相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
[0030] 1、本发明的寄生菌分离步骤采用的植株是人工回接步骤中得到的自然发病的植 株，而不是采用田间病株，寄生菌分离步骤之后仅经过一次转皿即可用单孢进行超低温贮 藏，获得具有良好的活力的单胞子系。
[0031] 2、本发明得到一批菌系（7~9个单孢系）所需要时间将从半年缩短到1个月，较 前分离的速度得到显著提高。
[0032] 3、本发明有效地剔除了腐生菌的存在，能够准确获得万寿菊黑斑病病原菌。
【附图说明】
[0033] 图1 :实施例1中叶部带有大型病斑的植株的照片。
[0034] 图2 :实施例1中叶部带有小型病斑的植株的照片。
[0035] 图3:实施例1中莖部带有病斑的植株的照片。
[0036] 图4 :实施例1中PDA培养基平板上的疑似寄生菌的菌落。
[0037] 图5:实施例1中显微镜（40x10)下看到的未接种成功的孢子（40x10)的照片。
[0038] 图6 :实施例1中显微镜（40x10)下看到的接种成功的孢子（40x10)的照片。
[0039] 图7 :实施例1中作为单孢系的孢子在PDA培养基平板长出的菌落的照片。
[0040] 图8 :实施例1中万寿菊黑斑病田间发病症状的照片；其中，（a) (b)为叶片发病症 状，（c)为茎发病症状，（d)为田间发病中后期。
[0041]图9 :实施例1中万寿菊黑斑病病原菌鉴定的照片；其中，（a)为PDA培养基上的 病原菌正面菌落形态，（b)为PDA培养基上的病原菌反面菌落形态，（c)为菌丝、孢子形态 (10X20)，（d)为孢子形态（10X40)，（e)为回接后万寿菊幼苗叶片发病症状，（f)为回接 后万寿菊幼苗植株发病症状。
【具体实施方式】
[0042] 一种通过回接分离获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法，包括以下步骤：
[0043] 步骤一、病残植株采集：采集万寿菊杂交种幼苗的黑斑病的田间病残植株，常温下 干燥保存。
[0044] 在步骤三的接种前，可以保湿诱发混有杂菌的寄生菌；该保湿诱发的操作为：将 该病残植株在无菌水中浸泡3-6小时（比如：3小时、5小时、6小时中任意或任意之间的范 围，优选为4小时），使病残植株完全湿润，再将湿润的病残植株放在密闭空间里保湿40-60 小时（比如：40小时、50小时、60小时中任意或任意之间的范围，优选为4小时），湿度为 100%〇
[0045] 步骤二、孢子悬液配制：选取黑霉比较明显的病残植株，刮取其茎段上的黑霉（即 混有杂菌的寄生菌），用蒸馏水配制成孢子浓度为5000-15000个孢子/毫升（比如：5000 个孢子/毫升、8000个孢子/毫升、12000个孢子/毫升、15000个孢子/毫升中任意或任意 之间的范围，优选为10000个孢子/毫升）的孢子悬液。
[0046] 步骤三、回接（优选为人工回接）：将该孢子悬液接种于万寿菊幼苗，得到自然发 病的植株。
[0047] 上述接种的操作为：
[0048] 取孢子悬液，用微型喷雾器喷洒在健康的万寿菊幼苗上；以喷洒无菌水的健康 的万寿菊幼苗为对照，将喷洒后所有的幼苗放入保湿桶中，为保证叶面长时间的为水膜所 覆盖，桶内盛有40-60°C(比如：40°〇、451：、551：、601：中任意或任意之间的范围，优选为 50°C)的无菌水，水面高度达到种植有万寿菊幼苗的营养钵高度的0.3-0. 8 (比如：0. 3、 0. 4、0. 45、0. 5、0. 7. 0. 8中任意或任意之间的范围，优选为0. 6);再将空气加湿器放入保湿 桶内，然后将保湿桶封严，使桶内空气湿度达到100%;待30-50小时（比如：30小时、25小 时、45小时、48小时、50小时中任意或任意之间的范围，优选40小时）后，从保湿桶中取出 所有的万寿菊幼苗，让植株自然发病，得到自然发病的植株。
[0049] 上述保湿桶优选为60L的塑料整理箱。
[0050] 步骤四、寄生菌分离：选取生长于该自然发病的植株的带有病斑的部分，消毒后接 种于PDA培养基粉末浓度为30-50g/L(比如：30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L中任意或 任意之间的范围，优选为39g/L)，的PDA培养基进行培养；7-10天后，得到疑似寄生菌的菌 落。
[0051] 上述PDA培养基的制备方法为：
[0052] 称取PDA培养基粉末，用蒸馏水加热溶解，定容，灭菌后冷却凝固成PDA培养基平 板，4°C保存待用；
[0053] 上述接种的操作为：
[0054] 取自然发病的植株的叶片，用清水冲两遍，吸水纸吸干水分，选取较典型的病斑， 剪成大约一厘米见方的小块；再用75%酒精溶液洗30秒，然后再使用15%的次氯酸钠溶液 消毒1~3分钟；再用无菌水漂洗两次后，剪成约2~3毫米见方的小块，再用无菌水洗一 次，分别放在PDA培养基平板上培养。
[0055] 本步骤采用的植株是人工回接步骤中得到的自然发病的植株，而不是采用田间病 株，之后仅经过一次转皿即可用单孢进行超低温贮藏，可以获得具有良好的活力的单胞子 系。
[0056] 步骤五、产孢：将该疑似寄生菌的菌落转到玉米培养基粉末浓度为70_80g/L(比 如：70g/L、72g/L、76g/L、78g/L、80g/L中任意或任意之间的范围，优选为75g/L)，玉米培养 基进行扩繁，诱发产生孢子，将孢子接种于万寿菊幼苗验证寄生性，选取有寄生性的菌株。
[0057] 上述验证方法按照科赫氏法则，从接种后发病的植株上再进行病原菌分离以及再 次接种，以确定分离物是否为致病菌。该玉米培养基的制备方法为：
[0058] 称取玉米培养基粉末，用蒸馏水加热溶解，定容，灭菌后冷却凝固成玉米培养基平 板，4°C保存待用；
[0059] 上述诱发产生孢子的操作为：待菌落长满玉米培养基后，采用"刮开法"诱发产生 孢子，即在无菌条件下刮除菌落表面菌系，开皿培养，培养2-6天即能产孢子。