芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基及发酵方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及蛋白酶和发酵培养基，尤其是涉及芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培 养基及发酵方法。
【背景技术】
[0002] 伴随着养殖业的快速发展、集约化程度的提高以及沿海水质的日益恶化，水产养 殖动物爆发性病害日益增多。虽抗生素及化学药物的应用在一定程度上缓解和控制了水产 生物病害的发生和蔓延，但随之而来的弊端也日渐显露。它不仅违背人们所倡导的健康养 殖宗旨，同时也干扰养殖环境及水生动物微生态平衡，导致水产动物对病原微生物的易感 性，更严重的是病原菌的耐药性增强，使得水产养殖病害防治工作越加困难。另外，抗生素 在水生动物体内的残留、富集，使得水产品质量降低，成为了水产品销售量和出口贸易量的 限制因素。
[0003] 1986年，Kozasa等首次利用芽抱杆菌处理日本饅麵降低了由于感染爱德华氏菌 而引起的死亡后，益生菌在水产研宄方面得到迅速发展。益生菌是指"当摄入一定量时对 宿主健康有作用的微生物活体"，具有无毒副作用、无残留、无耐药性等优点。现阶段益生菌 在水产养殖中的应用，主要体现在通过改善养殖对象体内外的微生物群落，增大养殖对象 对饲料的摄食率，增强其营养价值，同时提高养殖对象的免疫能力，以此提高养殖对象的产 量，在鱼类与贝类的养殖中都发挥积极的作用。近年来，对益生菌制剂在水产养殖方面的理 论与应用研宄已逐渐成为世界范围内的热潮。我国农业部公布了 5种能够应用于动物养殖 的微生物，包括乳酸杆菌、芽孢杆菌、酵母菌、粪链球菌和双歧杆菌。
[0004] 芽孢杆菌，多属芽孢杆菌属，革兰氏染色阳性，大多为好氧或兼性厌氧。其具有分 解转化和适应能力强，可代谢产生蛋白酶、淀粉酶、酯酶等多种酶类，提高养殖对象对饲料 的吸收与转化，促进动物生长，同时其对养殖对象和人类无害等特点，使其在作为饲料微生 态添加剂和水体微生态调节剂上都有广阔的应用前景。芽孢杆菌作为益生菌的作用机理表 现在（1)降低养殖水体中有毒物质含量，改善水环境；(2)提高动物的机体免疫力、减少病 害发生几率；(3)提高动物消化酶活力、促进快速生长；(4)调节动物体内微生态平衡等方 面。因此，提高益生菌的消化酶活力，有利于促进宿主健康生长。芽孢杆菌的一个重要特征 是，当环境苛刻或营养供给不足时，在芽孢杆菌内会形成一个近似圆形的内生孢子，成为芽 孢。此时，细菌的新陈代谢几乎停止，对不利的条件具有极强的抵抗性，具有耐高温、耐干 燥、耐酸碱的特点。因此芽孢杆菌制剂易于保存与运输，在恶劣条件下仍不影响其品质，活 化后可以继续投入使用。微生态制剂中芽孢杆菌形成的芽孢数量是一个判断微生态制剂质 量的重要指标。
[0005] 目前，对益生芽孢杆菌的研宄包括两个方面：其一，筛选优良菌株，构建庞大的益 生菌资源库。其二，对于已知的有益菌株，通过研宄优化其培养条件，降低培育成本、提高菌 株产量与活性，具有重要的现实意义。芽孢杆菌的发酵培养是工业化大规模生产芽孢杆菌 制剂的如提。
[0006] 本申请人在中国专利201210016016. 2中公开一种用于鲍养殖的肠道益生菌粉及 其制备方法，其中披露了芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440,该菌于2011年09月17日 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 5253。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基。
[0008] 本发明的另一目的在于提供一种采用芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基用 于鲍养殖的肠道益生菌的发酵方法。
[0009] 所述芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基的原料配方为：蛋白胨7g/L、酵母膏 7g/L、NaC120g/L、CaCl20. 2g/L，pH为 9. 0;所述芽抱杆菌为芽抱杆菌（B.stratosphericus) A3440,该菌于2011年09月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为CGMCCNo. 5253 (参见本申请人的在先中国专利申请201210016016. 2)。
[0010] 所述采用芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基用于鲍养殖的肠道益生菌的发 酵方法如下：在锥形瓶中装入已消毒灭菌的芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基，再将 芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440的种子液接种至锥形瓶中进行发酵培养，即完成采 用芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基用于鲍养殖的肠道益生菌的发酵。
[0011] 所述锥形瓶可采用250mL锥形瓶，发酵培养基的加入量可为30mL;所述消毒灭菌 的温度可为120°C，消毒灭菌的时间可为30min;所述接种的接种量按质量百分比可为芽孢 杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基的8% ;所述发酵培养的条件可置于恒温摇床上进行发 酵培养，培养温度30°C，培养时间24h。
[0012] 本发明通过优化发酵条件，提高了菌液的芽孢率与蛋白酶活力。经试验，在优化条 件下芽孢率为94. 3%，较出发培养基提高8. 77% ;蛋白酶活力为294. 44U/mL，较出发培养 基提高76. 67%。有利于芽孢杆菌的培养，降低后续工作的成本。
[0013] 本发明优化了芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440的培养条件，为芽孢杆菌制 剂的工业化生产提供理论依据与技术支持。
【附图说明】
[0014] 图1是本发明中酪蛋白标准曲线。
[0015] 图2是本发明中芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440的生长曲线。
[0016] 图3是本发明中不同碳源对芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440产蛋白酶的影 响图。
[0017] 图4是本发明中不同碳源对芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440产芽孢的影响 图。
[0018] 图5是本发明中不同氮源对芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440产蛋白酶的影 响图。
[0019] 图6是本发明中不同氮源对芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440产芽孢的影响 图。
[0020] 图7是本发明中不同无机盐对芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440产蛋白酶的 影响图。
[0021] 图8是本发明中不同无机盐对芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440产芽孢的影 响图。
[0022] 图9是本发明中不同金属离子对芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440产蛋白酶 的影响图。
[0023] 图10是本发明中不同金属离子对芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440产芽孢的 影响图。
[0024] 图11是本发明中不同温度对芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440产蛋白酶的影 响图。
[0025] 图12是本发明中不同温度对芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440产芽孢的影响 图。
[0026] 图13是本发明中不同接种量对芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440产蛋白酶的 影响图。
[0027] 图14是本发明中不同接种量对芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440产芽孢的影 响图。
[0028] 图15是本发明中不同装液量对芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440产蛋白酶的 影响图。
[0029] 图16是本发明中不同装液量对芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440产芽孢的影 响图。
[0030] 图17是本发明中不同初始pH值对芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440产蛋白 酶的影响图。
[0031] 图18是本发明中不同初始pH值对芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440产芽孢 的影响图。
【具体实施方式】
[0032] 以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
[0033] 芽抱杆菌（B.stratosphericus)A3440,于2011年09月17日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 5253(参见本申请人的在先中国 专利申请 201210016016. 2)。
[0034] 1材料与