一种沉默df-1细胞系中oasl基因的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种沉默DF-1细胞系中2'，5'寡聚腺苷酸合成酶样 (2'，5'oligoadenylatesynthetases-like, 0ASL)基因的方法，用于提高禽流感病毒在该 细胞系中的增殖滴度，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 随着集约化养殖业的迅猛发展，禽流感等家禽重要疫病正成为公共卫生安全领域 的焦点，从源头上控制疫病是当前防控策略的重中之重。实践证明，疫苗免疫和快速检测是 防控重大动物疫病最有效的措施。由于禽流感病毒细胞培养的滴度较低，目前国内仍主要 采用禽胚生产疫苗，效率低、耗能高，存在外源病毒污染的可能。我国农业"十二五"规划已 将重大动物疫病防控技术研宄和农产品安全生产与质量控制技术研宄列入重大关键技术 攻关。
[0003]DF-1细胞是一种稳定的、无肿瘤基因的、可传代的鸡胚成纤维细胞系，细胞形态呈 纤维状，该细胞缺少禽白血病病毒，肉瘤病毒内源性基因，被广泛用于动物病毒研宄、疫苗 研制及癌症研宄等诸多领域。0ASL是一种寡聚腺苷酸合成酶，研宄表明，RNA病毒如丙肝病 毒、流感病毒等感染患者的细胞中0ASL水平较高，高水平0ASL可增强人类机体细胞检测病 毒RNA的能力，从而激活机体的免疫系统抑制病毒复制。因此，建立一种沉默DF-1细胞系 中0ASL基因的方法，可有效提高禽流感病毒在DF-1细胞系中的增殖滴度，大大降低疫苗生 产成本，对于我国禽流感的预防和控制具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是克服现有禽流感疫苗生产中存在的不足，提供一种沉默DF-1细 胞系中0ASL基因的方法，可提高禽流感病毒在DF-1细胞系中的抗原量达5-10倍，不仅能 解决疫苗抗原量不足以及生产成本较高的问题，而且推动禽流感生物反应器细胞培养技术 的研发进程。
[0005] 本发明的技术方案是：一种沉默DF-1细胞系中0ASL基因的方法，其特征是，
[0006](1)根据0ASL基因，设计RNA干扰靶点序列的多个siRNA，进一步筛选出mRNA水 平上敲低0ASL基因表达的siRNA;
[0007] (2)构建表达上述筛选的0ASL基因siRNA(OASLRNAi基因）的慢病毒载体；
[0008] (3)通过上述慢病毒载体，将0ASL基因siRNA(OASLRNAi基因）导入DF-1细胞 系，沉默0ASL基因的表达，提高禽流感病毒在DF-1细胞系中的增殖滴度。
[0009] 进一步地，所述步骤（1)的筛选方法是：将设计的多个SiRNA插入pLKO.1-TRC克 隆载体中，转染DF1细胞，再收获并提取细胞总RNA，采用荧光定量PCR方法筛选mRNA水平 干扰0ASL基因的有效siRNA。
[0010] 进一步地，所述步骤（1)筛选得到的siRNA为shl:5 '-AA GGACAGTAACAAGACCACA-3,;
[0011] 进一步地，所述步骤⑵的慢病毒载体为LV-OASL-RNAi;
[0012] 上述慢病毒载体的构建方法为，包括以下步骤：
[0013] 1)根据上述siRNA的DNA序列设计合成单链DNAoligo,退火配对产生双链，再通 过两端所含的酶切位点直接连入酶切后的RNAi慢病毒载体GV248中，将连接产物转入制备 好的细菌感受态细胞，PCR方法鉴定阳性重组质粒GV248-0ASL;
[0014] 上述双链为：
[0015]OASL-RNAi-1：5 '-CCGGAAGGACAGTAACAAGACCACA CTCGAGTGTGGTCTTGTTACTGTCCTTTTTTTG-3r ；
[0016] 0ASL-RNAi-2 :5'-AATTCAAAAAAAGGACAGTAACAAGACCACACTCGAGTGTGGTCTTGTTAC TGTCCTT-3r ；
[0017] 2)大量提取重组质粒GV248-0ASL，与辅助质粒pHelperl. 0、pHelper2. 0混合后通 过脂质体（Lip〇fectamine2000)转染293T细胞，收集培养48h的细胞上清液，经离心，上清 液过滤后得到慢病毒载体LV-OASL-RNAi。
[0018] 进一步地，所述步骤（3)通过慢病毒载体LV-OASL-RNAi将0ASL基因 siRNA(0ASLRNAi基因）介导入DF-1细胞系，包括以下步骤：
[0019] 1)将DF-1细胞接种至细胞培养皿中，待生长密度达70 %时，接种慢病毒 LV-〇ASL-RNAi；
[0020] 2)以含10 y g/mL聚凝胺的10%FBSDMEM培养基稀释LV-〇ASL-RNAi至终浓度为 5 X 106PFU/mL，进而通过10倍倍比稀释，获得至少3个不同的病毒滴度，分别接种至DF-1细 胞中；同时设定阳性病毒对照；
[0021] 3)将接种LV-〇ASL-RNAi的DF-1细胞置37°C条件下5%0)2维持培养4h，更换为 含5%FBSDMEM培养基，继续培养至48h，更换含4y g/mL嘌呤霉素的10% FBSDMEM培养 基，筛选出阳性细胞克隆。
[0022] 本发明具有下列优点：
[0023]1.本发明将三个shRNA插入pLKO.1-TRC克隆载体中，通过转染收获并提取细胞总 RNA，采用荧光定量PCR方法筛选mRNA水平干扰0ASL基因的有效siRNA，为筛选siRNA提供 了一种快速、准确、高通量的方法。
[0024] 2.本发明利用慢病毒载体系统，将干扰0ASL基因的shRNA快速连接到慢病毒载体 系统，通过转染获得一种含有0ASLRNAi基因的慢病毒。
[0025] 3.本发明通过慢病毒将0ASLRNAi基因介导入DF-1细胞系，建立一种沉默DF-1 细胞系中0ASL基因的方法，可提高禽流感病毒在DF-1细胞系中的抗原量达5-10倍，大大 降低疫苗生产成本，不仅能解决疫苗抗原量不足以及生产成本较高的问题，而且推动禽流 感生物反应器细胞培养技术的研发进程。
【附图说明】
[0026] 图1是设计筛选的三个siRNA在0ASL基因的位置及筛选出的有效siRNA(shl);
[0027] 图2是pLKO. 1质粒经Age I酶切琼脂糖凝胶电泳产物，其中M泳道为DNAmarker DL15000 ;第1泳道为pLKO. 1质粒Age I酶切产物；第2泳道为pLKO. 1质粒对照；
[0028] 图3是pLKO. 1质粒经Age I和EcoR I双酶切琼脂糖凝胶电泳产物，其中M泳道 为DNAmarkerDL15000 ;第1泳道为pLKO. 1质粒AgeI和EcoRI酶切产物；
[0029] 图4是pLKO. 1质粒经Agel和EcoRI双酶切琼脂糖凝胶回收产物，其中M泳道为 DNAmarkerDL15000 ;第1泳道为pLKO. 1质粒AgeI和EcoRI酶切回收产物；
[0030] 图5是pLKO. 1-TRC-0ASL质粒经EcoRI和NcoI双酶切鉴定产物，其中M泳道为 DNAmarkerDL15000 ;第 1 泳道为pLKO. 1-TRC-0ASL质粒经EcoRI和NcoI双酶切产物；
[0031] 图6是0ASL有效shRNA筛选荧光定量PCR检测的ACt值；
[0032] 图7是载体GV248示意图；
[0033] 图8是荧光显微镜下观察慢病毒LV-〇ASL-RNAi感染293T细胞；其中左图为普通 光视野，右图为荧光视野；
[0034] 图9是禽流感病毒1215株在DF-1、DF-1A0ASL细胞中TCID5Q测定。
【具体实施方式】
[0035] 一、干扰0ASL基因转录的siRNA筛选
[0036] 1、干扰0ASL基因的shRNA的寡核苷酸序列的设计与合成
[0037] 根据Genbank中登录的0ASL基因序列，结合addgene慢病毒载体构建程序，于 http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext网站设计 3个RNA干扰革巴点序列的siRNA(如图 1 所示），同时设立对照组Scramble，序列如下：shl:5'-AAGGACAGTAACAAGACCACA-3'(SEQ No. 1) ;sh2 :5 '-AACTGCAGAAGAACTTTGTGA-3 '(SEQNo. 2) ；sh3 ：5r-AA GTACTATTCCCTGGAGGAT-3,(SEQNo. 3);Scramble:CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG(SEQNo. 4)，根 据pLKO. 1-TRC克隆载体特性，将siRNA的DNA序列与其相应的互补序列以loop序列连接形 成正义链和反义链，并在两端引入接头序列，通过退火形成shRNA。序列由宝生物工程（大 连）有限公司合成。
[0038]2、干扰0ASL基因pLKO. 1-TRC-0ASL载体的构建与鉴定
[0039] 参考Addgene公司pLKO. 1-TRC克隆载体说明书操作，将pLKO. 1-TRC克隆载体于 37°C经AgeI酶切2h，回收载体片段（如图2所示），将经AgeI酶切回收片段于37°C以 EcoRI酶切2h，分别获得7kb、1. 9kb的片段（如图3所示），回收7kb线性载体（如图4所 示）。回收片段与退火形成的shRNA序列16°C连接过夜，转化感受态菌DH5a，挑取单克隆 菌落，经过夜培养后提取质粒pLKO. 1-TRC-0ASL，以EcoRI及NcoI双酶切鉴定，1%琼脂糖 凝胶电泳检测，获得2kb、5kb的片段（如图5所示）。鉴定的阳性的克隆利用pLKO. 1测序 引物（5'-CAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGA-3'SEQNo. 5)进行测序。
[0040] 3、检测引物的设计与合成
[0041] 采用SYBRGreenI荧光定量PCR方法（ABI7300)扩增靶基因0ASL，同时设定内 参0 -actin。其中0ASL片段长度为106bp，参考NM_205041. 1序列；0 -actin片段长度为 113bp，参考NM_205518. 1序列，引物序列如下：
[0042] 0ASLF：AGATGTTGAAGCCGAAGTACCC(SEQNo. 6)；
[0043] 0ASLR：CTGAAGTCCTCCCTGCCTGT(SEQNo. 7)；
[0044] 0-actinF：ATTGTCCACCGCAAATGCTTC(SEQNo. 8)；
[0045]0-actinR：AAATAAAGCCATGCCAATCTCGTC(SEQNo. 9)〇
[0046]SYBRGreenI荧光定量PCR方法所用引物采用ACt验证靶基因与内参扩增的平 行性，以上引物序列由宝生物工程（