防御素mNP-1在促进鸡体重增加中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及防御素及其在制备饲料添加剂中的应用。具体地，涉及利用小球藻生 产的防御素mNP-1及表达mNP-1的小球藻及其在制备饲料添加剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 防御素的结构特点及分类
[0003] 防御素是一类广泛存在于动物、植物和人类体内具有微生物抗性的阳离子小肽。 防御素一般由29-54个氨基酸组成，分子量为3-6KD。在结构上具有以下共同特点：（1)带 正电荷，（2)富含精氨酸，（3)具有一定数目的保守的半胱氨酸，（4)通过半胱氨酸分子形 成分子内二硫键，使肽环合形成反向平行的0片层结构。自1985年美国加利福尼亚大学 Lehrer教授对其命名以来（Selsted et al.，1985a)，受到国内外科学家的广泛关注。根据 分子大小、结构与功能的差异，可将防御素大致分为四类：a防御素、0防御素、昆虫防御 素与植物防御素。基于半胱氨酸残基的间距和二硫键的形式，哺乳动物的防御素可分为三 类：a防御素、0防御素和0防御素。哺乳动物的防御素由18-42个氨基酸组成，其中6 个保守的半胱氨酸形成了 3对二硫键，使肽链折叠成0片层结构。a防御素由29-36个氨 基酸组成，二硫键的连接方式为1-6、2-4、3-5 ; 0防御素由38-42个氨基酸组成，二硫键的 连接方式为1-5、2-4、3-6，0防御素中还有一个脯氨酸和甘氨酸；1999年从非人灵长类恒 河猴中发现了新的一类防御素一一由18个氨基酸残基组成的环状0防御素，它们是由两 个不同的截短的a防御素类肽连接而成。
[0004] 防御素在人体中广泛分布，人体中a防御素有6种，其中4种即HNP1-4主要产生 于粒细胞，2种（HD5-6)主要产生于潘氏细胞；人类基因组有28个防御素基因，在人类 和鼠类已经鉴定出超过35个防御素基因。防御素的表达与病源微生物的入侵是紧密 相关的，例如在透析病人的腹腔中同时发现有a防御素与0防御素，又如细菌性脑膜炎患 儿的脑脊髓液中防御素的浓度比非细菌性脑膜炎高150倍。眼内防御素的表达研宄表明， 防御素在泪液中的含量与感染时的表达不同。研宄表明防御素在人体防病抗病中起着非常 重要的作用。
[0005] 到目前为止，分离到的兔防御素有9个，其中7个为a防御素：NP-l，NP-2，NP_3a， NP-3b，NP-4，NP-5和Corticostatin VI，产生于粒细胞。另外2个来自于兔肾细胞的防 御素：RK-1和RK-2。a -防御素NP-1比人防御素HNP-1的抗菌活性强5~10倍，两者间 的这一明显差异被归结为它们的分子净电荷性质：在NP-1分子中含有9个净正电荷，而在 HNP-1分子中仅含有3个净正电荷。目前，从生物体中分离到的防御素已达30多种，其中 兔防御素（Netrophile Peptide-1，NP-1)的抗性谱最广。兔防御素NP-1由33个氨基酸 组成，属于a-防御素，有6个半胱氨酸，它们形成3个二硫键，连接位置分别为1-6, 2-4， 3-5 (Ganz，1989)。它对梅毒螺旋体、很多革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和病毒有显著 的抑制或毒杀效应。
[0006] 防御素抗微生物机理
[0007] 在动植物及人体内，防御素含量极其少，却执行着机体重要的防御功能。与传统抗 生素相比，防御素有其独特的抑制机理。
[0008] 防御素的抗菌作用机理为：它依靠静电作用，通过本身所带的正电荷与带负电荷 的微生物细胞膜相互吸附，即防御素与革兰氏阴性菌的脂多糖（LPS)、革兰氏阳性菌的脂磷 壁酸等阴离子分子作用而附着在靶细胞表面，二聚或多聚的防御素穿膜形成瞬时的或稳定 的跨膜离子通道（兔防御素NP-1形成瞬时的，人防御素HNP-1形成稳定的跨膜离子通道）， 导致细胞内溶液外渗，从而扰乱了细胞膜的通透性及细胞能量状态，导致细胞膜去极化，呼 吸作用受到抑制以及细胞内ATP含量下降，最终导致靶细胞死亡。
[0009] 防御素的抗病毒作用则是通过与病毒外壳蛋白结合而导致病毒失去生物活性。
[0010] 哺乳动物的细胞膜含有丰富的固醇和中性磷脂，其中中性磷脂包括磷脂酰乙醇 胺（phosphatidyl-ethanolamine，PE)，磷脂酰胆喊（phosphatidyl-choline，PC)，鞘磷脂 (sphingo-myelin，SM)。哺乳动物细胞膜中的胆固醇可通过影响磷脂流动性和偶极化来降 低抗菌肽的作用，此外胆固醇还具有稳定脂质双分子层和延缓抗菌肽结合到膜上的作用。 因此，哺乳动物的细胞膜留醇可用来区分哺乳动物细胞和真菌细胞（Nozdrachev et al.， 2006)。然而，在细胞膜上的胆固醇不是影响特异性的唯一分子，因为真菌也含有胆固醇，但 真菌中的麦角留醇对抗菌肽敏感。正是微生物细胞膜和细胞成分与哺乳动物细胞膜成分的 差异，影响着抗菌肽作用的选择性和特异性。
[0011] 正是由于这些特殊的作用机理，使得目的微生物难以产生抗防御素的抗性变异， 因此防御素被认为是一种新型低耐药性甚至无耐药性的抗感染肽类药物。
[0012] 不同防御素的抗微生物活性
[0013] 由于不同来源的防御素在结构上有一定的差异，因此它们的抑菌谱亦有很大差 另|J。各种a -防御素对革兰氏阴性菌、阳性菌，分枝杆菌、真菌、被膜病毒、HIV病毒在不同程 度上都有抑制作用，其作用剂量大部分在1-100 μg/ml之间（Patterson-Delafied et al.， 1980，1981;Lehrer et al.，1983,1985a，1985b，1986,1989 ;Selsted et al.，1984,1985b， 1987,1992 ;Ganz，1985 ;Segal et al.，1985 ;Daher et al.，1986 ;Levitz et al.，1986; Shafer et al. ，1988 ;Eisenhauer et al. ，1989 ;Yamashita and Saito,1989 ;Cullor et al.，1990,1991 ;Miyasaki et al.，1990a，1990b，1990c ;Borenstein et al.，1991a， 1991b ;Kohashi et al.，1992 ;0gata et al.，1992 ;Nakashima，1993) D 与其它抗微生物狀 相比，防御素具有更广的抗性谱，尤其是兔防御素NP-l，NP-2,不但抗性谱广，抑菌活性也较 强。
[0014] 1984年，Selsted等发现从兔中性粒细胞分离获得的NP-1在浓度为50 u g/ml时 对3个家系的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)，表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis)，月市炎链球菌（Staphylococcus pneumoniae)，无乳链球菌（Staphylococcus agalactiae)，李斯特菌(Listeria monocytogenes)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，大肠杆菌（Escherichia coli)，月市