一种检测肝癌风险基因tspyl5甲基化水平的试剂盒及方法
【专利说明】-种检测肝癌风险基因TSPYL5甲基化水平的试剂盒及方 法
[0001]
技术领域
[0002] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测肝癌风险基因基化水 平的试剂盒及方法。
【背景技术】
[0003] DNA甲基化是表观遗传学研宄的主要内容之一，研宄的是基因碱基序列不发生改 变的情况下发生的可逆的遗传性改变，是一种DNA分子复制后共价修饰方式。在真核生物 中，DNA甲基化指在DNA甲基转移酶（DNMTs)的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体将 甲基转移至DNA分子中的特定碱基上的过程，它主要发生在CpG二核苷酸中的胞嘧啶上。 在基因组中，CpG二核苷酸分布相对集中的区域称为CpG岛（CpG islands，CGIs)，大小在 100~lOOObp，主要位于基因的启动子区和第一外显子区；CpG岛的异常甲基化可以直接导 致相关基因的表达沉默。DNA特定的甲基化模式对于维持基因组稳定性及基因正确的时空 表达具有重要意义，甲基化模式的异常改变将会直接参与人类疾病甚至癌症的发生。
[0004] 甲基化敏感性限制性内切酶技术结合PCR的方法（Methylation-sensitive restriction enzyme digestion and PCR，MSRE_PCR)是基于甲基化敏感性限制性内切酶 对甲基化位点不切割的特性，将DNA消化为不同大小的片段后再进行PCR扩增，根据电泳产 物差异分析甲基化状态。具体原理参见图1，选用对特异DNA片段甲基化序列敏感的限制性 内切酶进行酶切后，以待测甲基化位点外侧序列为扩增起始点进行PCR。该DNA片段若存在 甲基化，将会有扩增产物出现；若无甲基化，则不会有任何片段扩增出现。当用甲基化不敏 感的内切酶消化产物作为PCR模板时，不论该部位是否甲基化都不应有片段扩出。
[0005] 重亚硫酸盐克隆测序（bisulfite sequencingPCR，BSP)的方法，提取的DNA经 亚硫酸氢盐修饰后，未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成脲嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持 不变。经过PCR脲嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。PCR产物琼脂糖电泳后切胶纯化，随后连接 到PMD18-T载体，转化大肠杆菌，过夜培养后挑单个阳性克隆提取质粒进行测序，得到每个 DNA分子特定区域甲基化位点的分布图，从而得到该区域各个CpG位点的甲基化状态。该方 法是一种可靠性及精确度很高的检测甲基化状态的方法，能够明确目的片段中每一个CpG 位点的甲基化状态。在寻找有意义的关键性CpG位点上，有其他方法无法比拟的优点。然 而该方法耗费时间、资金以及精力，至少要测序10个以上的克隆才能获得可靠数据，需要 大量的克隆及质粒提取测序，过程较为繁琐、昂贵。故而难以在临床实现高通量的自动化检 测，但却可以作为甲基化检测新方法的对比方法。
[0006] 本试剂盒拟建立基于甲基化敏感性限制性内切酶结合荧光定量PCR (MSRE-qPCR) 的方法，将MSRE-PCR方法的后续检测改为荧光定量PCR，可以定量检测微量DNA样品特定基 因位点的甲基化水平。该方法使用方便，无需进行亚硫酸氢盐处理，而且对石蜡切片有良好 的兼容性。
【发明内容】
[0007] 基于此，本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性良好的检测肝癌风险基因 狎基化水平的试剂盒。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现： 一种用于检测75P7L5基因甲基化的荧光定量PCR的方法，包括如下步骤：①提取待测 样本基因组DNA ;②使用甲基化敏感性限制性内切酶对基因组DNA进行酶切；③使用引物对 A对酶切产物进行荧光定量PCR扩增；④对PCR产物的Ct值进行分析；⑤根据分析结果判 断样本中基因的甲基化水平。
[0009] 其中，步骤③中的引物对A优选为以下四对引物中的一对(括号内表示引物对扩 增片段的长度）： AF1 :5' -CCCCGCGAGCGCATATCAGAG -3'（176bp)， AR1 :5' -GCAACCGCCGACGTCACGAAC-3' ； AF2 :5' -ATATCAGAGAAACTCGCCGAG-3' （150bp)， AR2 :5' -CACGAACGTACAACTGTACCG-3' ； AF3 :5' -CAGAGAAACTCGCCGAGACCTA-3' （231bp)， AR3 :5' -TTCAAAGACACGCTGTGACCCT-3' ； AF4 :5' -AGCGCATATCAGAGAAACT-3' （140bp)， AR4 :5' -GTACCGTCGCGAGAGGACGTGA-3'。
[0010] 上述引物通过如下方法设计得到：从UCSC数据库获得7S°7L5基因CpG岛序列， 通过分析该序列中的酶切位点，采用在线引物设计软件（http://simgene. com/Primer3) primer premier 3.0设计包含2-6个酶切位点的PCR引物。经过反复试验筛选和验证，得 到了扩增效率高、特异性好，能够检测样本/^7Z遥因甲基化水平的引物。
[0011] 一种基于甲基化敏感性限制性内切酶结合荧光定量PCR检测7S°7L5基因甲基化 水平的试剂盒A，包含上述引物对A。
[0012] 所述的试剂盒A还包含甲基化敏感性限制性内切酶。
[0013] 所述的试剂盒A还包含甲基化阴性对照和阳性对照。优选的，阴性对照包括正常 人外周血DNA、商业化未甲基化的人类基因组DNA对照；阳性对照包括商业化的完全甲基化 的人类基因组DNA、已证实的靶基因片段完全甲基化的肝癌细胞系DNA。
[0014] 所述的试剂盒A还包含荧光定量PCR的SYBR Green荧光染料等。
[0015] 上述试剂盒A的使用方法，包括如下步骤：①提取待测样本基因组DNA;②使用甲 基化敏感性限制性内切酶对基因组DNA进行酶切；③使用引物对A对酶切产物进行荧光定 量PCR扩增；④对PCR产物进行Ct值分析。
[0016] 所述的酶切的体系优选为：DNA 300ng，Buffer (10X )5 y L，甲基化敏感性限制性 内切酶30U，ddH20补足至50 y L。
[0017] 所述的PCR扩增的反应体系优选为：SYBR Mix (2X)10yL，上游引物（F)0. 5yL， 下游引物（R) 0. 5 y L，ddH20 7 y L，酶切产物2 y L。
[0018]所述的 PCR 扩增的反应条件优选为：95°C 5min ;95°C 30s，61°C 30s，72°C 30s， 35-40 cycles〇
[0019] 本发明基于甲基化敏感性限制性内切酶结合荧光定量PCR的试剂盒A可以分为检 测系统和监控系统两个部分。检测系统包括上述引物对A，可由其中的任意一种组合而成。 监控系统则包括：①阴性对照包括2种，第1种是已经证实的待测区域为非甲基化的的正常 人基因组DNA模板；第2种是商业化的非甲基化人类基因组DNA对照。正常情况下所有阴 性对照的甲基化水平应趋近0,否则表明加样过程有污染或者酶切不完全。②阳性对照为商 业化的完全甲基化的人类基因组DNA、已证实的靶基因片段完全甲基化的肝癌细胞系DNA; 正常反应下阳性对照的甲基化水平应趋近1，否则说明实验失败。
[0020] 另一种用于检测75P7L5基因甲基化的BSP的方法，包括如下步骤：①提取待测样 本基因组DNA;②使用亚硫酸氢钠对基因组DNA进行修饰；③使用引物对B对修饰后的DNA 进行PCR扩增；④PCR产物克隆测序分析每个CG位点的甲基化情况。
[0021] 其中，步骤③中的引物对B包括外侧引物（W)和内侧引物（N)，其中外侧引物为以 下3对中的一对： BWF1 :5' -TAAGAGATAATTGGAGGA-3'（465bp)， BWR1 :5' -ACCTTTACCCCGATTTTTA-3' ； BWF2 :5' -ACGTTCGAGTATTTTTTTTA-3' （498bp)， BWR2 :5' -GACCTTTACCCCAATTTTTA-3' ； BWF3 :5' -AGATAATTGGAGGAGTTGAAGA-3' （526bp)， BWR3 :5' -TACTATAAAAAATCCGAATCGC-3' ； 内侧引物为以下4对引物中的一对： BNF1 :5' -AATAGGTGATGGGGGATAGGT-3'（376bp)， BNR1 :5' -CCGCTCATAATAACGACGAAA-3' ； BNF2 :5' -AGAAAATAGGTGATGGGGGA-3' （383bp)， BNR2 :5' -CGACCGCTCATAATAACGAC-3' ； BNF3 :5' -TTAGAAAATAGGTGATGGGGGATAG-3' （373bp)， BNR3 :5' -ATAACGACGAAAACAACTTCAAAAA-3' ； BNF4 :5' -AATAGGTGATGGGGGATAG-3' （378bp)， BNR4 :5' -GACCGCTCATAATAACGAC-3'。
[0022] 上述引物通过如下方法设计得到：从UCSC数据库获得7S°7L5基因CpG岛序 列，用于BSP方法的引物采用在线甲基化引物设计软件（http://www. urogene. org/ methprimer/)MethPrimer设计。经过反复试验筛选和验证，得到了扩增效率高、特异性好， 能够检测样本基因甲基化水平的BSP引物。
[0023] 一种基于亚硫酸氢钠修饰的PCR检测7S°7L5基因甲基化水平的试剂盒B，包含上 述引物对B。
[0024] 所述的试剂盒B还包含甲基化阴性对照和阳性对照。优选的，阴性对照包括正常 人外周血DNA、商业化非甲基化的人类基因组DNA对照；阳性对照包括商业化的甲基化人类 基因组DNA、已证实的靶基因片段完全甲基化的肝癌细胞系DNA。
[0025] 所述的试剂盒B还包含PCR试剂（dNTPs、DNA聚合酶、DNA聚合酶buffer等）以及 亚硫酸氢钠修饰过程所需的试剂(亚硫酸氢钠、氢醌、氢氧化钠、乙酸铵、糖原等)。
[0026] 上述试剂盒B的使用方法，包括如下步骤：①提取待测样本基因组DNA ;②使用亚 硫酸氢钠对基因组DNA进行修饰；③使用引物对B对修饰后的DNA进行PCR扩增(依次使用 外侧引物和内侧引物进行巢氏PCR扩增）；④PCR产物克隆测序分析每个CG位点的甲基化 情况。
[0027]所述的 PCR 扩增的反应体系优选为：Buffer (10X)5yL，dNTPs(10mM)l yL，MgCl2 (25mM)4yL，Taq (lU/yL)2yL，上游引物（F) lyL，下游引物（R) lyL，ddH20 32 yL，DNA 模板4yL。
[0028] 所述的巢氏PCR扩增外侧、内侧的反应条件均优选为：95°C，5min ;95°C，30s， 68°C -56°C，2cycles/2°C，45s，72°C，45s，退火温度降至 56°C 时进行 25cycles ;72°C， 10min〇
[0029] 本发明发现了 75P7L5基因甲基化与肝癌发生的关联性，并鉴定了 75P7L5的甲基 化位点，结合甲基化敏感性限制性内切酶以及特定的引物，建立荧光定量PCR的检测方法。 而且随后采用BSP的方法对这一结论进行了验证。
[0030] 本发明所述的基因甲基化检测试剂盒的灵敏度高达80. 37%，特异度高达 93. 25%〇
[0031] 本方法利用荧光定量PCR方法检测DNA甲基化，大大提高了检测效率，降低了检测 成本。检测结果简单，直观，而且高通量，一次可检测许多样本。
【附图说明】
[0032] 图1是MSRE-PCR原理图；图中，CH3表示甲基化，enz表示甲基化敏感性限制性内 切酶；左图DNA无甲基化，DNA被切断，无法得到PCR产物；右图DNA有甲基化，DNA保持