新的胚胎干细胞培养体系及胚胎干细胞建系方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物学技术领域，具体涉及新的用于胚胎干细胞的新的培养体系W及 采用所述培养体系提高胚胎干细胞建系效率的方法。
【背景技术】
[000引1981年，英国科学家马了 ?埃文斯首次建立了小鼠胚胎干细胞系，开启了胚胎干 细胞领域的研究工作巧vansandKaufman, 1981)。此后，NicholasM.Gou曲等发现一种被 称之为白血病抑制因子（LeukemiaInhibito巧化ctors,LI巧的化合物，它能够维持小鼠 胚胎干细胞保持未分化状态，使得小鼠ESCs能够在体外长期稳定地传代培养（Williamset al.，1988)。随着研究的愈发深入，科学家们对小鼠ESCs的多能性调控机制的研究也越来 越透彻（Niwaetal. ,2009)，该样也推进了小鼠培养体系的跟进和发展。从最初的胎牛血 清培养基，到Invitrogen公司推出KoSR替代胎牛血清，再到应用最为广泛的"代胎体系"， 培养基的发展实现了从有血清到无血清、从成分不明确到确定化学成分的过程；而且通过 培养基的不断更新和发展，具有不同遗传背景的小鼠品系，如巧7BL/ 6、DBA2、CBA、N0D等， 均在体外成功地得到了ESC细胞系，该对于疾病模型的建立、转基因及胚学研究都具有重 要意义。
[0003] 然而，具有不同遗传背景的小鼠胚胎体外建立ESCs细胞系的能力是不一样的 (Hannaetal. ,2009)。远交封闭群来源的ESCs体外建系能力是最容易的，如129Sv、CD-l 等，利用传统的胎牛血清培养体系，就可W高效率建立ESCs细胞系，但是近交品系来源的 小鼠ESCs在此培养条件下建系则十分困难，如巧7BL/6、NOD等，其建系效率几乎为零。 随着KoSR血清替代品的出现，近交系小鼠ESCs的建系效率得到了极大的提高，但是其不同 细胞系的生长状态差异较大，不是特别稳定。
[0004] Evans，M.J等人（'Establishmentincultureofpluripotentialcellsfrom mouseembiyos'，化1:脚6(1981)292(5819) ;154-6;Williams,R.L.等人（'Myeloid leukaemiainhibitoryfactormaintainsthedevelopmentalpotentialofembryonic stemcells'，化Uire(1988)336(6200) ;684-7)公开了"FBS(15%)的培养体系，但是该体 系只限于特殊背景（如封闭群品系小鼠）的胚胎干细胞建系，而对于其他背景（如近交系 小鼠）的胚胎干细胞建系则无法实现，且在"FBS(15% )"体系内，胚胎干细胞的生长状态一 般，克隆集落相对较小。
[0005] Cheng,J等人（'ImprovedgenerationofC57BL/6Jmouseembryonic stemcellsinadefinedserum-freemedia'，Genesis(2004) 39(2) ;100-4)介绍了 "K〇SR(20% )的培养体系，从成分上看，"K〇SR(20% )"体系与"FBS(15% )"体系相比较， 只是用KoSR代替FBS而已，其余成分和浓度均一致。KoSR的使用实现了不同遗传背景的胚 胎干细胞均能建系的目的，尤其是对近交系小鼠的胚胎干细胞建系起到了很大的推动作用 (化engetal.，2004)。但是该培养体系培养出的胚胎干细胞的状态不稳定，该主要体现在 细胞集落表面不光滑、易出现"白点"（由死细胞产生的），部分细胞成扁平状生长（表明细 胞开始分化）及细胞集落的立体感不强等。
[0006] Ying QL等人（The ground state of embryonic stem cell self-renewal'， 化1:脚6(2008)453(7194) ;519-23) ;Hanna，J.等提出 了胚胎干细胞"GroundState"的概念， 首次提出利用在N2B27基础培养液中添加MEK抑制剂PD032590UGSK3目抑制剂CHIR99021 和LIF(又称"2i体系"）的方法建立小鼠ESCs细胞系，取得了突破性的成果，该体系对于稳 定ESCs多能性状态是非常重要的（Theunissen et al. ,2011)。但是其对于近交品系ESCs 的建系效率并无显著性提高，细胞增殖较慢，细胞集落在"2i"体系中一般都很小，而且对于 近交系背景的胚胎干细胞，其建系效率也不是很高。
[0007] 所W目前仍需研究出一种新的培养体系W达到支持不同遗传背景的胚胎干细胞 建系和培养的目的。
【发明内容】
[0008] 针对现有技术中存在的现状，本发明提供了用于胚胎干细胞的新的培养体系、W 及采用本发明所述培养体系提高胚胎干细胞建系效率的方法。本发明新型培养体系及其方 法的意义在于既能保证得到稳定的胚胎干细胞系，又能够显著性提高胚胎干细胞的建系效 率，从而更好地推动胚胎干细胞在转基因和疾病模型领域的广泛应用。
[0009] 本发明所述培养体系包括；DMEMF12、N-2Supplement、B-27Supplement、目-琉基 己醇、谷氨醜胺、膜岛素、牛血清白蛋白、双抗（青霉素+链霉素）、P加325901、化ir99021、 白血病抑制因子（LIF)、KnockoutSerumR巧lacement化oSR)、P53inhibitor、Y-27632、 P38MAPKinhibitor和化rskolin。
[0010] 作为本发明实施方式之一，所述培养体系中W培养体系的总量为基础计、DMEMF12 为90%~97%，优选为92%~96%;N-2Supplement为l:50~l:200，优选为l:80~ 1 : 120;b-27Supplement为1 : 25~1 : 100,优选为1 : 25~1 : 75;目-琉基己醇 为0. 05mM~0. 2mM,优选为0. 07mM~0. 15mM ;谷氨醜胺为ImM~5mM,优选为2mM~4mM ; 膜岛素为10 yg/血~50 yg/血，优选为10 yg/血-30 yg/血；牛血清白蛋白为 0.001%~0.005%，优选为0.002%~0.004%;双抗（青霉素+链霉素）为1 : 50~ 1 : 100,优选为1 : 70~1:100;P加325901为0. 8uM~2uM，优选为0. 8uM~1.5UM; Chir99021为3uM~lOuM，优选为3uM~6uM;白血病抑制因子（LI巧为1000U~ 10000U,优选为1000U~6000U;Knockout SerumR巧lacement化oSR)为 3%~10%,优选 为 3%~8% ;P53inhibitor为 2yM~50yM，优选为 2yM~10yM;Y-27632为 5yM~ 10yM，优选为 5yM~8yM;P38MAPK inhibitor为5uM~20yM优选为yM5-8yM;和 ForskOlin为lOuM~20yM，优选为lOuM~15uM。所述体系中涉及比例的及百分比的 组分，其均W质量为计量单位。
[0011] 作为本发明实施方式之一，所述培养体系中，DMEMF12包括但不限于例如由GIBC0 公司提供；N-2Supplement包括但不限于例如由GIBC0公司提；B-27Supplement包括但 不限于例如由GIBC0公司提供；目-琉基己醇包括但不限于例如由Sigma公司提供；谷氨 醜胺包括但不限于例如由GIBC0公司提供；膜岛素包括但不限于例如由Roche Applied Sciences公司提供；牛血清白蛋白包括但不限于例如由Sigma公司提供；双抗（青霉素+ 链霉素）包括但不限于例如由GIBC0公司提供；Pd0325901包括但不限于例如由Stemgent 公司提供；化ir99021包括但不限于例如由Stemgent公司提供；白血病抑制因子（LI巧包 括但不限于例如由Millipore公司提供；KnockoutSerumReplacement化oSR)包括但不 限于例如由GIBC0公司提供；P53inhibitor包括但不限于例如由化化iochem公司提供； Y-27632包括但不限于例如由化化iochem公司提供；P38MAPKinhibitor包括但不限于例如 由化化iochem公司提供；Forskolin包括但不限于例如由Stemgent公司提供。
[0012] 作为本发明进一步实施方式之一，所述培养体系W总溶液的量为基础计为：
【主权项】
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